SPF雞和商品蛋雞糞便菌群及大腸桿菌抗藥性的比較分析

摘 要：通過糞菌移植可以調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，已成為降低腸道菌群抗藥性的方法之一，而篩選合適的糞菌移植供體尤為重要。本研究利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)分析了兩種候選供體SPF雞和商品蛋雞在不同養(yǎng)殖模式下5個不同日齡糞便菌群的組成，并利用藥物敏感性試驗比較了糞便中大腸桿菌的抗藥性水平。結(jié)果表明，兩種蛋雞糞便菌群的豐富度都表現(xiàn)出隨日齡增加而增加的趨勢，其中商品蛋雞糞便菌群的種類更加豐富，而SPF雞糞便菌群的組成更加均一。在門水平上，SPF雞擁有更多的厚壁菌門細菌，而商品蛋雞含有更多的變形菌門、擬桿菌門和放線菌門細菌。在屬水平上，兩種蛋雞糞便中的優(yōu)勢菌均為乳酸桿菌屬和埃希氏-志賀氏菌屬，其中SPF雞存在更多的乳酸菌屬和隱秘桿菌屬，而商品蛋雞含有更多的擬桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬和克雷伯菌屬。藥敏試驗結(jié)果表明，SPF雞糞便中大腸桿菌對抗生素的抗藥率、多重抗藥性比例和最低抑菌濃度（MIC）的頻率分布均顯著低于商品蛋雞。該結(jié)果深入分析了兩種養(yǎng)殖模式下不同日齡蛋雞的糞便菌群，結(jié)合糞便中大腸桿菌抗藥性水平的比較分析，進一步表明SPF雞糞便菌群更加安全、敏感，可以作為糞菌移植的供體用于降低腸道菌群的抗藥性。

關(guān)鍵詞：SPF雞；商品蛋雞；糞便菌群；抗藥性

家禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的不合理使用加速了細菌抗藥性的產(chǎn)生，這不僅降低了抗生素的藥效，而且導(dǎo)致抗藥菌在食物鏈的傳播，危及食品安全和公共衛(wèi)生[1]。此外，治療特定病原菌的抗生素多為廣譜抗生素，而廣譜抗生素的使用同時會破壞宿主正常的腸道菌群，增加宿主患二次感染的風(fēng)險[2]。因此家禽養(yǎng)殖業(yè)中迫切需要減少抗生素的使用、降低細菌抗藥性。

過去15年左右，大量文獻報道腸道菌群對宿主的健康存在重要影響[3，4]。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）是將健康者（供體）糞便菌群移植給患者（受體）以恢復(fù)其紊亂的腸道菌群的技術(shù)，多用于治療腸道相關(guān)疾病，尤其是復(fù)發(fā)性艱難梭菌的感染[5，6]。有文獻報道，在治愈患者復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染的同時，糞菌移植降低了患者腸道內(nèi)抗藥基因的種類和豐度，而且減少了變形菌門細菌的豐度[7]。糞菌移植在降低艱難梭菌感染患者腸道細菌的抗藥性上取得成功，考慮將糞菌移植應(yīng)用到雞身上，以期降低細菌抗藥性，而糞菌移植實施的前提是選擇良好的供體。

SPF雞在封閉環(huán)境中養(yǎng)殖，不使用抗生素，飼喂無菌的飼料和水，且不攜帶特定病原體。而商品蛋雞在開放式環(huán)境中養(yǎng)殖，在生長的某個階段使用部分抗生素。兩種雞的養(yǎng)殖方式不同，這可能會對雞的糞便菌群和抗藥性產(chǎn)生影響。本研究中，利用16SrRNA基因高通量測序技術(shù)和藥敏試驗技術(shù)比較分析了SPF雞和商品蛋雞的糞便菌群結(jié)構(gòu)及糞便中大腸桿菌的抗藥性水平，以期為糞菌移植篩選合適的供體用于降低細菌抗藥性的研究。

1 方法與材料

1.1 樣品采集 選擇采集雞糞樣品的SPF雞場和商業(yè)蛋雞場，分別位于濟南市長清區(qū)和德州市齊河縣。SPF雞品種為白來航雞，而商品蛋雞為海蘭褐。飼料依據(jù)國家標準配制。采集5個不同時間點的雞的糞便，包括2周齡（育雛期）、19周齡（產(chǎn)蛋起始期）、25周齡（產(chǎn)蛋高峰期）、46周齡（減產(chǎn)期）和71周齡（淘汰期）。采樣期間雞場未發(fā)生疫病，SPF蛋雞不使用抗生素或疫苗。商用蛋雞90日齡前使用過土霉素、鏈霉素、紅霉素、氨芐西林和卡那霉素。在這兩種蛋雞場里，不同日齡的雞在不同的雞舍。一個雞舍采集20個點，混勻得到3個生物學(xué)重復(fù)樣本，兩種蛋雞各5個日齡，所以總共得到30份樣品。糞樣放置干冰中帶回實驗室進行大腸桿菌分離后，在提取DNA前在液氮中保存。

1.2 糞樣DNA 抽提和PCR擴增 根據(jù)E.Z.N.A.■soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95℃ 變性30s，55℃退火30s，72℃ 延伸30s），最后72℃延伸 10min（PCR儀：ABI GeneAmp■9700型）。擴增體系為20μl，4μl 5×Fast Pfu緩沖液、2μl 2.5mM dNTPs、0.8μl引物（5μM）、0.4μl FastPfu 聚合酶和10ng DNA模板。

1.3 Illumina Miseq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA） 進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA） 進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)處理 原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接：①設(shè)置50bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長度低于50bp的序列；②barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基；③根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10bp，去除無法拼接的序列。使用的UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。

1.5 大腸桿菌的分離鑒定和藥敏試驗 每種類型每個時間點的糞便樣品在3個麥康凱培養(yǎng)基（Merck Millipore，德國）進行劃線，在37℃下培養(yǎng)18～24h后選取疑似大腸桿菌菌落，利用VITEK■ 質(zhì)譜儀進行鑒定（BioMerieux，法國）。每種類型的雞糞便都獲得45株大腸桿菌用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗，確定抗生素種類——氨芐西林、多西環(huán)素、氟苯尼考、頭孢噻呋、新霉素、慶大霉素和多粘菌素對大腸桿菌的最小抑菌濃度，根據(jù)CLSI標準2016版判定結(jié)果[8]。

1.6 生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法 主坐標分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA），LEfSE分析在上海美吉生物免費云平臺進行（https：//www.i-sanger.com/）。變異系數(shù)（coefficient of variation）為標準差與平均值的商（SD/Mean）。在軟件GraphPad Prism7中利用Mann-Whitney算法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因高通量測序數(shù)據(jù)分析 在方法與材料中已經(jīng)列出了兩種類型蛋雞5個時間點的糞便樣本。在進行Illumina MiSeq測序和質(zhì)量過濾（quality-filtering）后，30個樣本總共獲得1，148，889個序列（sequences），序列平均長度為442 bp。為了降低每個糞便樣本間的測序深度差異造成的影響，這些序列被統(tǒng)一抽平至樣本中最小序列數(shù)（每個樣本16，718個序列）。

2.2 SPF雞糞便菌群豐富度低于商品蛋雞，但組成更加均一 為了比較SPF雞和商品蛋雞糞便菌群的豐富度，我們統(tǒng)計了兩種糞便樣本中OTUs的數(shù)量，以及計算了辛普森指數(shù)（Simpson index），發(fā)現(xiàn)兩種蛋雞糞便菌群α多樣性有顯著的差異。SPF蛋雞糞便菌群（SPF）中OTU的數(shù)量顯著低于商品蛋雞（COM），但辛普森指數(shù)前者顯著高于后者（P<0.001，Mann-Whitney test）（圖1A），這一結(jié)果表明SPF雞糞便菌群豐富度低于商品蛋雞，但其菌群更加均一。值得一提的是，兩種蛋雞糞便菌群都表現(xiàn)出隨日齡增加而增加的趨勢（圖2A）。30個樣本總共獲得1330個OTUs，其中商品蛋雞組有1270個OTUs，而SPF雞組有511個OTUs。兩組共同擁有451個OTU（圖1B），且其中的208個在豐度上存在顯著差異（P<0.05，Mann-Whitney test）（圖2B）。

Chao指數(shù)變異系數(shù)（coefficient of variation）用來衡量蛋雞糞便菌群豐富度的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPF蛋雞糞便菌群的豐富度穩(wěn)定性大于商品蛋雞，而且兩組都在25周齡的日齡點時擁有較為穩(wěn)定的糞便菌群豐富度（圖2C，D）。

基于Brays-Curtis算法的主坐標分析發(fā)現(xiàn)，SPF雞組內(nèi)糞便菌群聚成一組，與商品蛋雞可顯著區(qū)分開，表明兩種蛋雞糞便菌群組成顯著不同。與此相似，基于Unweighted UniFrac距離的柱狀圖也表明，SPF雞組內(nèi)不同日齡間雞的糞便菌群組成相似程度要大于商品蛋雞糞便菌群，反之如此 （圖1C，D）。

雞的日齡可能是影響雞糞便菌群發(fā)展因素之一，我們以雞的日齡作為一個影響糞便菌群的影響因子，在SPF雞和商品蛋雞組內(nèi)對不同日齡雞的糞便菌群進行比較，主坐標分析發(fā)現(xiàn)，無論SPF雞還是商品蛋雞，雞的日齡在雞糞便菌群的發(fā)展中都起到了一定的作用（圖3A，B）。

綜上，可以看出養(yǎng)殖模式及日齡都會影響雞的糞便菌群。

2.3 兩種蛋雞糞便菌群在門（phylum）和屬（genus）水平的組成 β多樣性分析結(jié)果顯示不同養(yǎng)殖模式和不同日齡都影響蛋雞糞便菌群的發(fā)展。通過將所得的OTUs在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫中進行比對，得到了具體的糞便菌群組成。在門（phylum）分類水平上，SPF蛋雞和商品蛋雞糞便菌群都主要由厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes） 及放線菌門（Actinobacteria）組成。但是兩者在這四個菌門的細菌相對豐度卻具有顯著差異，SPF蛋雞糞便菌群擁有更多的厚壁菌門細菌，而含有較少的變形菌門、擬桿菌門和放線菌門細菌（圖4A；圖5A）。

在屬（genus）分類水平上，有9個屬的細菌相對豐度在所有樣本中大于1%（圖4B），兩者蛋雞的糞便菌群主要由乳桿菌屬（Lactobacillus）、埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）細菌組成，SPF蛋雞糞便菌群含有更多的乳桿菌屬、糞桿菌屬（Faecalibacterium）細菌，而商品蛋雞含有更多的擬桿菌屬（Bacteroides）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、梭菌屬（Clostridium）、鏈球菌屬（Streptococcus）以及克雷伯菌屬（Klebsiella）細菌（圖5B）。

2.4 SPF雞糞便中大腸桿菌的抗藥性水平低于商品蛋雞 藥敏試驗結(jié)果顯示SPF雞糞便中大腸桿菌對7種抗生素抗藥性水平顯著低于商品蛋雞（P=0.0156，Mann-Whitney test；圖6A），鑒定的45株糞便大腸桿菌中有5株表現(xiàn)1重抗藥，5株表現(xiàn)2重抗藥，無3重及以上抗藥菌株。而商品蛋雞鑒定的45株糞便大腸桿菌中至少有1株表現(xiàn)1重抗藥，22株表現(xiàn)至少3重抗藥（圖6B）。MIC的頻率分布顯示SPF雞糞便大腸桿菌的MIC集中于熱圖底部，而商品蛋雞大腸桿菌菌株的MIC多集中于熱圖上部，整體來看SPF雞糞便大腸桿菌的抗藥性水平顯著低于商品蛋雞（圖6C）。兩組內(nèi)大腸桿菌MIC平均水平顯示，SPF雞糞便大腸桿菌對氨芐西林、頭孢噻呋、多粘菌素、新霉素、多西環(huán)素的抗藥性水平都顯著低于商品蛋雞（圖6D）。

3 討論

雞的糞便、嗉囊、十二指腸、回腸和盲腸等部位的菌群組成不同[9]，由于盲腸菌群對雞的生理方面具有重要作用，因此雞腸道菌群的研究多關(guān)注盲腸[10]。盲腸菌群與糞便菌群組成不同，但是核心菌群相同，利用糞便樣本可以一定程度的展示盲腸菌群的動態(tài)變化[11]。我們利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)比較分析了兩種不同養(yǎng)殖環(huán)境下的蛋雞5個不同日齡的糞便菌群。結(jié)果SPF雞與商品蛋雞的糞便菌群在α多樣性和β多樣性方面明顯不同，SPF雞糞便菌群更加均一，而商品蛋雞菌群更加豐富，且菌群豐富度隨日齡增加呈現(xiàn)增加趨勢。兩種蛋雞糞便菌群在門和屬水平組成存在顯著差異，SPF雞擁有更少的變形菌門細菌，如假單胞菌屬、不動桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬和克雷伯菌屬等。有研究報道SPF雞糞便中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門豐度占95%以上；乳桿菌屬、鏈球菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬為優(yōu)勢菌屬[12]。也有研究表明200日齡SPF雞糞便菌群在門水平上主要由厚壁菌門、變形菌門組成，在屬水平主要由腸球菌屬組成[13]。本研究中，通過與普通商品蛋雞進行比較，發(fā)現(xiàn)SPF蛋雞糞便菌群擁有更多的厚壁菌門細菌，而含有較少的變形菌門、擬桿菌門和放線菌門細菌。雞的腸道菌群雖然會因不同區(qū)域有所不同，綜合來看，其腸道菌群是由較多厚壁菌門組成，且擁有較多乳桿菌屬和腸球菌屬細菌。

SPF雞糞便菌群豐富度較少的原因，可能是封閉環(huán)境、無菌飼料養(yǎng)殖造成的。有報道稱野生動物與家養(yǎng)動物的腸道菌群存在差別，散養(yǎng)雞比籠養(yǎng)雞腸道菌群更加豐富[14]，這表明與外界環(huán)境接觸可能會促進雞腸道菌群的發(fā)展。除了不同品種，不同養(yǎng)殖模式及地理環(huán)境對雞腸道菌群的發(fā)展也具有重要作用[15]。我們的研究結(jié)果也顯示不同養(yǎng)殖模式下SPF雞和商品蛋雞的糞便菌群顯著不同，且腸道菌群的豐富度會隨著日齡的增加而增加，這與國外其他報道也是一致的[16]。雞等家禽的腸道菌群在食物的消化、吸收以及抗病方面發(fā)揮重要作用[17]，因此，通過調(diào)節(jié)動物腸道菌群來提高動物表現(xiàn)的方法成為可能。研究人員嘗試通過益生菌、益生元，甚至是糞菌移植來調(diào)節(jié)動物的腸道菌群，提高動物表現(xiàn)。讓人驚喜的是，糞菌移植在治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌患者時，不僅可以調(diào)節(jié)受體宿主的腸道菌群，同時也可以清除大部分抗藥性機會致病菌[7]。SPF雞在無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，飼喂無菌水和無菌飼料，不使用任何抗生素，且糞便中大腸桿菌的抗藥性很低，菌群更加敏感，且SPF雞不攜帶特定病原體，安全性好。因此SPF雞作為糞菌移植合適的供體用于降低細菌抗藥性代表了一個安全有效的新方法。

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Comparative analysis of the fecal microbiota and Escherichia coli antibiotic resistance in specific-pathogen-free （SPF）and commercial layer chickens

ZHU Jianshen1，2，WANG Xi1，3，ZHANG Yin1，WANG Huaizhong1，ZHANG Qing1，LUO Yanbo1，

LI Lulu1，HU Ming1，DAI Meixue3，LIU Yuqing1，2，3，QI Jing1，3

（1.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding， Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；

2. School of Life Sciences， Shandong University， Jinan 250100， China；

3. School of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

Abstract：Modulating microbiota with fecal microbiota transplantation （FMT） is a novel way to reduce antimicrobial resistance （AMR） in chicken husbandry. However， optimal fecal microbiota donors are required for effective FMT.Here，we performed a 16S rRNA gene sequencing study to analyze the fecal microbiota composition of two candidate donors，specific-pathogen-free （SPF） chickens and commercial layer chickens （COM） exposed to different rearing environments at five different time-points. Antimicrobial susceptibility testing （AST） was performed to determine the antibiotic resistance of Escherichia coli （E.coli） isolated from the feces of the two types of chickens. The results showed that the composition of the fecal microbiota of both laying hens showed an increasing trend with increasing age， and the commercial layer chickens possessed more richness microbiota than SPF layer chickens， while SPF layer chickens harbored a more uniform microbiota community. In relation to phylum composition， SPF layer chickens possessed a greater abundance of Firmicutes， while commercial layer chickens possessed more Proteobacteria， Bacteriodetes and Actinobacteria. At the genus level， the dominant genera in both kinds of layer chickens were Lactobacillus， Escheria-Shigella.However，there was higher relative abundance in genus Lactobacillus and Faecalibacterium in SPF Group，while COM group possessed higher relative abundance in genus Bacteroides， Pseudomonas， Acinetobacter， Clostridium，Streptococcus and Klebsiella. AST showed that the E. coli isolated from commercial chicken feces had a high antibiotic resistance， multi- drug resistance ratio and minimum inhibitory concentration frequency distribution than the E.coli isolated from SPF chickens. This study deeply analyzed the differences in fecal microbiota of two different chickens at different ages. Combined with the comparison of E. coli antibiotic resistance， we believed that SPF chickens might be appropriate donors of fecal material for use in FMT to reduce AMR in the chicken industry.

Key Words：SPF chicken；commercial laying hens；fecal microbiota；antibiotic resistance□