擬南芥SPM12基因GFP載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株篩選

方雪 徐潔娜 孟杏楠 曹樹(shù)青 樊婷婷

摘要[目的]為了進(jìn)一步研究SPM12基因的功能，利用哥倫比亞（Columbia，Col）遺傳背景的野生型擬南芥材料構(gòu)建SPM12基因GFP載體及其轉(zhuǎn)基因植株。 [方法] 以野生型擬南芥的RNA反轉(zhuǎn)錄成的 cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出SPM12基因的CDS全長(zhǎng)序列，將其連接到GFP載體的質(zhì)粒上;然后將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR鑒定并測(cè)序后，將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。PCR鑒定出陽(yáng)性菌落后，通過(guò)浸花法將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥植株中。收種子后，使用帶有抗性的選擇性培養(yǎng)基篩選出陽(yáng)性植株。[結(jié)果]通過(guò)SPM12基因CDS片段和SPM12-GFP重組質(zhì)粒的獲得，構(gòu)建了SPM12-GFP載體和其轉(zhuǎn)基因植株。 [結(jié)論]成功獲得擬南芥SPM12-GFP轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究擬南芥SPM12基因的功能與分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞擬南芥;SPM12;載體;GFP轉(zhuǎn)基因植株

中圖分類號(hào)Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2019）02-0086-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.025

植物在其自然棲息地中經(jīng)常面臨過(guò)多的非生物和生物脅迫。適應(yīng)這種變化需要很大程度的表型可塑性，這主要取決于植物的基因組。目前尚不清楚植物是如何做到整合大量部分協(xié)同或拮抗的環(huán)境信號(hào)，從而使他們能夠在任何特定條件下做出響應(yīng)[1]。但顯而易見(jiàn)的是，植物在應(yīng)對(duì)各種脅迫時(shí)能夠做出相應(yīng)的抵御反應(yīng)。土壤中有害重金屬污染是世界范圍內(nèi)日益迫切的問(wèn)題，重金屬污染是對(duì)植物造成重大損害的因素之一[2-5]。筆者發(fā)現(xiàn)，SPM12基因使得擬南芥對(duì)重金屬鎘的脅迫有所響應(yīng)，為進(jìn)一步研究該基因的功能，通過(guò)構(gòu)建SPM12基因GFP載體及其轉(zhuǎn)基因植株，研究SPM12基因在鎘脅迫響應(yīng)中所起的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。該試驗(yàn)使用的植物材料為哥倫比亞（Columbia，Col）遺傳背景的野生型（wild-type，Col-0）擬南芥（Arabidopsis thaliana），購(gòu)于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心。載體構(gòu)建過(guò)程中所用大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、載體pXB94-GFP均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑。TIANprep Mini Plasmid Kit和TIANprep Mini Purification Kit 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;T4-DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶Kpn I和Eco RI購(gòu)自NEB公司;Eazy Taq DNA Polymerase和Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司; PrimeSTAR HS DNA Polymerase 購(gòu)自TaKaRa公司;Silwet-77購(gòu)自索萊寶公司;瓊脂、NaCl、氯仿、異丙醇、乙醇、蛋白胨、酵母粉、蔗糖均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);壯觀霉素、慶大霉素、卡那霉素均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1野生型擬南芥RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄。提前準(zhǔn)備好研缽，洗干凈后放入65 ℃烘箱烘干水分。用錫箔紙包裹放入180 ℃烘箱，高溫烘4～6 h后，冷卻至室溫，放入-20 ℃預(yù)冷冰柜備用。同時(shí)將氯仿、異丙醇、乙醇放入-20 ℃冰柜中預(yù)冷處理。離心機(jī)提前設(shè)置到4 ℃預(yù)冷。稱取無(wú)菌培養(yǎng)2周左右的野生型擬南芥（WT）材料100～300 mg，置于預(yù)冷的研缽中，用無(wú)菌紙杯取適量液氮加入研缽中，將樣品材料在液氮中充分研磨成粉末;向研磨破碎后的材料中加入1 mL Trizol裂解液（4 ℃保存）繼續(xù)研磨成液體;轉(zhuǎn)移研磨完成后的材料至1.5 mL的離心管（EP）中，于超凈臺(tái)中室溫靜置5 min;加入200 μL氯仿后劇烈震蕩約15 s;繼續(xù)室溫靜置5 min后，13 000 r/min、4 ℃離心10 min;取上清液500 μL轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，并加入500 μL異丙醇，輕輕顛倒混勻6～8次，室溫靜置10 min;然后13 000 r/min、4 ℃離心15 min（在此期間配制足量75%乙醇）;棄上清，留沉淀，沿著EP管壁緩緩加入1 mL 75%乙醇，8 000 r/min、4 ℃離心5 min;充分棄去上清，在超凈臺(tái)靜置晾干5～8 min后，加入30～50 μL DEPC水，65 ℃水浴溶解10 min，每5 min敲打一次，溶解完畢后置于冰上，吸取2 μL進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將所得RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3酶切、連接與大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。將所得目的基因片段和載體pXB94-GFP質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI在37 ℃下分別進(jìn)行雙酶切2和4 h，瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，使用T4-DNA Ligase將酶切后的基因片段和pXB94-GFP質(zhì)粒在16 ℃下連接12 h。取5 μL連接產(chǎn)物加至40 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min。然后42 ℃熱激50 s，迅速放冰上靜置2～3 min。加入600～800 μL無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基，放置在37 ℃搖床中，220 r/min培養(yǎng)1 h。4 000 r/min離心5 min，棄去部分上清，留下約200 μL將菌體沉淀重懸并涂布于帶有50 mg/L的壯觀霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基上，放在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落至裝有500 μL含50 mg/L壯觀霉素抗性的無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基的EP管中，220 r/min、37 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁，進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性菌株。

1.2.4農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。用測(cè)序比對(duì)正確的陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取出重組質(zhì)粒。取重組質(zhì)粒2 μL，加入50 μL GV3101感受態(tài)細(xì)胞，混勻后移至預(yù)冷的電擊杯中，1 800 V電擊;電擊完成后迅速取出，加入600～800 μL無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基，使用移液槍吹打混勻，盡可能多的將混合液移入無(wú)菌的1.5 mL EP管中，放入28 ℃搖床220 r/min培養(yǎng)3 h;4 000 r/min離心5 min。棄去部分上清，留下約200 μL將菌體沉淀重懸并涂布于帶有50 mg/L壯觀霉素和50 mg/L慶大霉素雙抗性的固體LB培養(yǎng)基上，放在28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)約48 h;挑取單菌落至裝有500 μL含50 mg/L壯觀霉素和50 mg/L慶大霉素雙抗性的無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基的EP管中，220 r/min、28 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁，進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性菌株。并使用50%甘油將陽(yáng)性菌株保存一部分于-80 ℃冰箱留作菌種。

1.2.5浸花法轉(zhuǎn)基因。將含有表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，5 000 r/min離心5 min收集菌體。用MS/蔗糖緩沖液重懸后，再次離心收集。用緩沖液再次重懸至OD600=0.5，按照1∶4 000的比例加入Silwet-77。剪去野生型擬南芥的果莢和已授粉的花，將未授粉得到花浸入侵染緩沖液約20 s后，裹上保鮮膜黑暗過(guò)夜培養(yǎng)，揭去保鮮膜后22 ℃正常培養(yǎng)。1周后，再次侵染。

1.2.5

轉(zhuǎn)基因植株的篩選。 收到擬南芥侵染后的第一代種子后，篩去雜質(zhì)，放置于37 ℃烘箱干燥15 d，然后密封放在4 ℃冰箱春化1周左右。使用時(shí)在超凈臺(tái)先用0.1%的氯化汞消毒1次，并用無(wú)菌水洗滌3次，將洗滌過(guò)的種子用無(wú)菌牙簽撥置于無(wú)菌濾紙上。待種子晾干后，撒在含50 mg/L卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上，用封口膜密封后置于4 ℃冰箱春化3 d。春化后，將培養(yǎng)基放在恒溫22 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周。因?yàn)榭敲顾啬軌蛴绊懼参锶~綠體和線粒體的蛋白合成從而引起植物黃化而死亡，而轉(zhuǎn)基因植物由于帶有卡那抗性能夠抑制卡那的作用，所以能夠通過(guò)卡那培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)有陽(yáng)性植株的培養(yǎng)皿進(jìn)行拍照，并將陽(yáng)性植株移栽土培。土培2周后可選蓮座葉提取DNA進(jìn)行PCR復(fù)驗(yàn)證。

2結(jié)果與分析

2.1目的片段的PCR擴(kuò)增

利用無(wú)菌培養(yǎng)2周的擬南芥提取的RNA反轉(zhuǎn)錄出的cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的基因SPM12的片段，該片段長(zhǎng)度為561 bp，從圖1中瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果來(lái)看，擴(kuò)增出的條帶與該基因片段的長(zhǎng)度相吻合。通過(guò)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收基因片段。

2.2目的基因與pXB94-GFP質(zhì)粒的雙酶切

由于在設(shè)計(jì)克隆目的基因的引物時(shí)根據(jù)不同載體所攜帶的酶切位點(diǎn)，選擇性設(shè)計(jì)了2個(gè)最優(yōu)的酶切位點(diǎn)KpnI和EcoRI分別加在上下游引物的5′端。取30 μL基因片段和20 μL pXB94-GFP質(zhì)粒的溶液，每個(gè)限制性內(nèi)切酶各加1 μL，相應(yīng)各加入5 μL的Cutsmart，用ddH2O配足50 μL，目的基因酶切時(shí)間為2 h，pXB94-GFP質(zhì)粒的酶切時(shí)間為4 h。圖2中雙酶切的結(jié)果顯示酶切效果良好，無(wú)拖尾，無(wú)雜帶。條帶大小與目的基因和質(zhì)粒分別相符。用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。使用T4-DNA Ligase將酶切后的目的基因與pXB94-GFP質(zhì)粒載體在16 ℃的金屬浴中連接12 h。

2.3大腸桿菌重組質(zhì)粒陽(yáng)性菌落的PCR鑒定

將連接產(chǎn)物通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在壯觀霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上過(guò)夜后，挑取陽(yáng)性菌落培養(yǎng)一定時(shí)間，通過(guò)PCR鑒定獲得陽(yáng)性菌落，圖3為大腸桿菌重組質(zhì)粒陽(yáng)性菌落PCR鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，顯示與目的基因大小符合。經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)，得到含目的基因的重組質(zhì)粒載體。

2.4農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆的PCR鑒定

用質(zhì)粒小提試劑盒提取測(cè)序比對(duì)正確的大腸桿菌重組質(zhì)粒，并提取出的重組質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 mg/L慶大霉素和壯觀霉素雙抗性的LB固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d左右，挑取單菌落活化，然后進(jìn)行菌落PCR鑒定。農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌落的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖4）說(shuō)明，目的基因成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

2.5轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的抗性篩選

通過(guò)浸花法侵染野生型擬南芥，將收到的種子撒在帶有卡那霉素抗性的MS固體培養(yǎng)基上，陽(yáng)性植株會(huì)正常生長(zhǎng)（圖5），陰性植株因不含轉(zhuǎn)基因攜帶的抗性而黃化死亡。2周后，將陽(yáng)性株系移栽土培。

為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因成功的株系，提取轉(zhuǎn)基因株系的DNA進(jìn)行PCR鑒定，如圖6，成功擴(kuò)增出SPM12的CDS片段，從而更進(jìn)一步地確定了陽(yáng)性植株為轉(zhuǎn)基因成功的株系，也說(shuō)明成功構(gòu)建了擬南芥SPM12基因的GFP載體并得到了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。

3討論

自然界中和人為造成的重金屬污染對(duì)很多農(nóng)業(yè)土壤造成不同程度的污染。人為造成的污染主要包括工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)以及農(nóng)業(yè)活動(dòng)中使用的含有重金屬的肥料[6-7]。受到重金屬污染的土壤會(huì)造成很多農(nóng)作物產(chǎn)品如各種水果與蔬菜中含有很高的重金屬成分[8-9]。鎘是重金屬污染中最危險(xiǎn)的因素之一，對(duì)植物和農(nóng)作物具有很強(qiáng)的毒性，鎘能夠通過(guò)與巰基結(jié)合使得蛋白質(zhì)變性失活，從而造成動(dòng)植物的細(xì)胞損傷[10-13]。通過(guò)研究對(duì)重金屬脅迫有所響應(yīng)的基因有助于篩選出優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物品種。由于SPM12基因能夠?qū)︽k脅迫做出應(yīng)答，通過(guò)SPM12基因的GFP載體和該基因的GFP轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建，對(duì)后續(xù)研究該基因的功能與分子機(jī)制做出了一定的貢獻(xiàn)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品安全有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] PANDEY S P，SOMSSICH I E.The role of WRKY transcription factors in plant immunity[J].Plant physiology，2009，150（4）：1648-1655.

[2] SHI W Y，SHAO H B，LI H，et al.Progress in the remediation of hazardous heavy metalpolluted soils by natural zeolite[J].Journal of hazardous materials，2009，170（1）：1-6.

[3] GJORGIEVA D，KADIFKOVAPANOVSKA T，RUSKOVSKA T，et al.DNA-damage and total antioxidant status in two selected medicinal plants subjected to heavy metal phytotoxicity[C]// Conference on medicinal and aromatic plants of southeast European countries.[s.l.]：[s.n]，2012：127-127.

[4] SYTAR O，KUMAR A，LATOWSKI D，et al.Heavy metal-induced oxidative damage，defense reactions，and detoxification mechanisms in plants[J].Acta physiologiae plantarum，2013，35（4）：985-999.

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2019年

[5] SHAW B P，SAHU S K，MISHRA R K.Heavy metal induced oxidative damage in terrestrial plants[M]//PRASAD M N V.Heavy metal stress in plants.Berlin Heidelberg：SpringerVerlag，2004：84-126.

[6] LEE J，BAE H，JEONG J，et al.Functional expression of a bacterial heavy metal transporter in Arabidopsis enhances resistance to and decreases uptake of heavy metals[J].Plant physiology，2003，133（2）：589-596.

[7] ROSS S M.Sources and forms of potentially toxic metal in soil-plant system[M]// ROSS S M.Toxic metals in soil-plant systems.New York：John Wiley & Sons，1994：3-25.

[8] SHAFFER M.Waste lands：The threat of toxic fertilizer[M].Los Angeles，CA：Californias Advocate for the Public Interest，2001.

[9] MENCH M J.Cadmium availability to plants in relation to major long-term changes in agronomy systems[J].Agric Ecosyst Environ，1998，67（2/3）：175-187.

[10] RASKIN I，SMITH R D，SALT D E.Phytoremediation of metals：Using plants to remove pollutants from the environment[J].Curr Opin Biotechnol，1997，8（2）：221-226.

[11] SHIM D，HWANG J U，LEE J，et al.Orthologs of the class A4 heat shock transcription factor HsfA4a confer cadmium tolerance in wheat and rice[J].Plant cell，2009，21：4031-4043.

[12] GALLEGO S M，PENA L B，BARCIA R A，et al.Unravelling cadmium toxicity and tolerance in plants：Insight into regulatory mechanisms[J].Environ Exp Bot，2012，83：33-46.

[13] GOYER R A.Toxic and essential metal interactions[J].Annu Rev Nutr，1997，17：37-50.