辣椒疫病病原菌的分離與鑒定

付靜 陳建中 付偉等

摘要 [目的]明確發(fā)生在邯鄲地區(qū)大名縣辣椒大棚中的疫病病原菌。[方法]從辣椒大棚里采集辣椒疫病病樣，對病原菌進行分離與純化，并通過形態(tài)學(xué)觀察、ITS序列分析及致病力測定，對病原菌進行鑒定。[結(jié)果]辣椒疫病病原菌為辣椒疫霉（Phytophthora capsici）。[結(jié)論]該研究為當(dāng)?shù)乩苯芬卟》乐翁峁┛茖W(xué)的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 辣椒;疫病;病原菌;分離;鑒定;辣椒疫霉

中圖分類號 S436.418.1文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0150-03

Abstract [Objective] The research aimed to identify the pathogen of pepper blight from Daming County of Handan area.[Method] Pepper disease samples were collected from greenhouses and the pathogen was isolated and purified.The pathogen of pepper blight was identified by comprehensive morphological characteristics，ITS DNA sequences analysis and pathogenicity test.[Result] The pathogen of pepper blight in Handan area was Phytophthora capsici.[Conclusion] The study provides a scientific theoretical basis for the prevention and control of local pepper blight.

Key words Pepper;Blight;Pathogen;Isolation;Identification;Phytophthora capsici

辣椒疫病是辣椒生產(chǎn)上的重要病害，目前已廣泛分布于我國的辣椒種植區(qū)。辣椒在苗期、成株期都可感染疫病，而且在田間擴展迅速，常造成辣椒生產(chǎn)的毀滅性破壞[1]。辣椒疫病的病原為辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian），屬于藻界卵菌門疫霉屬，其寄主范圍較廣，可引起多種重要作物病害[2]。辣椒疫霉菌以卵孢子在土壤中越冬，環(huán)境適宜時卵孢子萌發(fā)產(chǎn)生游動孢子侵入寄主，經(jīng)風(fēng)、雨、水等傳播，進行初侵染和再侵染[3]。為了明確邯鄲地區(qū)辣椒疫病病原菌的分類特征及為害特點，有效地控制辣椒生產(chǎn)中疫病的發(fā)生危害，筆者對邯鄲大名縣大棚辣椒疫病的病原菌進行分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 辣椒疫病病樣采自河北省邯鄲地區(qū)大名縣大棚栽培辣椒的根。病原菌的致病力測定中供試?yán)苯菲贩N為“瑞豐”“長健”“瑞朗”“尖椒1號”和“133”，采用常規(guī)育苗，長至1片真葉時選擇大小一致的健壯辣椒苗，移栽于盛有適量營養(yǎng)土的盆中，日光溫室內(nèi)常規(guī)管理。選擇8葉期長勢一致的健康植株用做致病力測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離和純化。

病原菌的分離采用組織分離法[4]，將辣椒疫病病株根部的外表皮除去，取內(nèi)部組織的病健交界處5 mm左右小塊，在75%乙醇中浸漬30 s，再用0.1%升汞水溶液處理4 min，然后用無菌水清洗3次，置于選擇性燕麥培養(yǎng)基平板上（含青霉素50 mg、五氯硝基苯50 mg、鏈霉素30 mg），25 ℃恒溫培養(yǎng)。

將長出的菌絲轉(zhuǎn)接到10% V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌絲長滿平板后，向平板中倒入滅菌的自來水沖洗一遍，去除菌絲表面的營養(yǎng)物質(zhì)，再加入滅菌的自來水至剛剛淹過菌絲面。置于日光燈下連續(xù)照光，經(jīng)過48 h，菌落表面可產(chǎn)生大量孢子囊。加入少量滅菌自來水至產(chǎn)生大量孢子囊的培養(yǎng)基平板中，4 ℃冰箱放置10 min后，取出室溫下放置30 min，刺激游動孢子的釋放[5]。調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度到4×10倍顯微鏡下每視野1個孢子左右，用移液槍吸取孢子懸浮液50 μL在水瓊脂平板上涂布均勻，12 h后低倍鏡下檢查、標(biāo)記單個孢子的位置，用移植鏟切取、移植含有單孢子的水瓊脂塊，轉(zhuǎn)至10% V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)[6]。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定。

在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌菌絲隔膜的有無、孢子囊和游動孢子的形態(tài)特征。將病原菌接種到燕麥、玉米粉、10%V8、PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d后，用直徑6 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌餅，移至4種培養(yǎng)基平板中央，分別轉(zhuǎn)接4皿，置于25 ℃培養(yǎng)。每隔24 h用十字交叉法測量菌落直徑，4 d后觀察病原菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定。

將純化的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，待其長出菌絲后，挑取0.1 g菌絲于1.5 mL 的離心管中，加液氮研磨至粉末。采用CTAB法提取DNA[7]。用真菌ITS區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對提取物進行PCR擴增。25 μL PCR 反應(yīng)體系包括10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.3 μL，ITS1 和ITS4 引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH2O定容至25 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行Blast對比分析，取相似性最高的序列和測定序列在ClustalX程序中進行完全比對。然后利用Mega 4.0軟件以鄰位相連（Neighbor-joining，NJ）算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

1.2.4 病原菌的致病力測定。

采用活體刺莖接種[9]，將在PDA平板上25 ℃條件下培養(yǎng)7 d的辣椒疫霉菌菌株沿菌落邊緣打成直徑為6 mm的菌餅。用滅菌的解剖針刺傷供試?yán)苯罚?葉期）的莖稈，然后將菌餅挑貼于傷口處，菌絲一面貼近傷口，用脫脂棉蘸水保濕24 h，24 h 后除去滅菌棉，以空白培養(yǎng)基塊接種作為對照。每處理重復(fù)10次，接種后的辣椒置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃保濕培養(yǎng)，24 h 后開始測量病斑長度，每12 h 測量1 次，根據(jù)病斑長度評價各菌株致病力的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化 從辣椒疫病病樣中分離的病組織塊上均長出白色絨毛狀的菌落，初步鑒定為同一菌株。將分離出的病原菌轉(zhuǎn)接到10% V8培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)誘導(dǎo)，在顯微鏡下觀察到了大量的孢子囊，對孢子囊進行刺激，釋放出大量游動孢子。將孢子涂布在WA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共挑取出3個單孢子，將菌株保存到PDA斜面培養(yǎng)基并命名為Bz。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

經(jīng)顯微鏡觀察，病原菌菌絲無隔膜，孢囊梗分枝不規(guī)則;孢子囊形狀長橢圓形、卵圓形，大多數(shù)有1個乳突，大小為 （36.403～86.594） μm × （19.794～41.247） μm，長寬比為1.009～2.702（圖1）。游動孢子腎形，帶有鞭毛，游動孢子游動一段時間后停止游動。初步確定其為辣椒疫霉。

從圖2可看出，病原菌在4種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀不同。在燕麥培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，絨毛狀，氣生菌絲很少，菌絲疏松、色白;在玉米粉培養(yǎng)基上的菌落接近圓形，棉絮狀，氣生菌絲較多，菌絲濃密、較厚，色白;在10%V8培養(yǎng)基上呈放射狀生長，菌落圓形、氣生菌絲很少，菌絲較疏松，色較淺;而在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，花瓣狀，氣生菌絲較少，菌絲較濃密、較厚，色白。

從表1可看出，病原菌在4種培養(yǎng)基上的生長速率各不相同。病原菌在燕麥培養(yǎng)基上的生長最快，在玉米粉和10%V8培養(yǎng)基上的生長較快，在PDA培養(yǎng)基上的生長最慢。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

以提取的辣椒疫霉菌株Bz的DNA為模板，使用通用引物ITS1和ITS4進行擴增，并對擴增產(chǎn)物進行序列測定，獲得長度為792 bp的特異性片段。將該片段序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，結(jié)果顯示，該序列與已報道的辣椒疫霉菌（登錄號：AJ854287.1）的序列相似性達99%。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取代表疫霉屬不同種的ITS序列，以Peronospora sparsa作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3聚類分析結(jié)果可知，菌株Bz與辣椒疫霉菌的rDNA-ITS聚在一起，而外群菌株P(guān)eronospora sparsa則以較遠的親緣關(guān)系處在系統(tǒng)發(fā)育樹的外圍。結(jié)合菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀，鑒定Bz為辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）。

2.4 病原菌的致病力測定

用辣椒疫霉菌株Bz接種5個辣椒品種的莖稈，在自然條件下培養(yǎng)3 d后，辣椒莖稈均出現(xiàn)褐色病斑，而對照未發(fā)病。菌株Bz對5個辣椒品種的致病力沒有顯著性差異，且致病力均強于標(biāo)準(zhǔn)菌株CT（表2）。之后病斑不斷擴大導(dǎo)致病株萎蔫，癥狀與大棚自然發(fā)病癥狀一致。從接種的病組織中分離的病原菌與從大棚發(fā)病植株分離的病原菌形態(tài)一致，證明該致病菌為辣椒疫病的病原菌。

3 結(jié)論與討論

該研究通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法，確定了發(fā)生在邯鄲地區(qū)大名縣辣椒大棚中的疫病病原菌為辣椒疫霉（Phytophthora capsici），通過致病力測定發(fā)現(xiàn)該病原菌可以侵染健康辣椒并導(dǎo)致辣椒疫病的發(fā)生。

發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉菌在玉米粉和燕麥培養(yǎng)基上生長最佳;張世才等[11]發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉菌在燕麥培養(yǎng)基上生長速度最快，但在V8培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多。該研究結(jié)果表明，辣椒疫霉菌在燕麥培養(yǎng)基上的生長最快，在10%V8培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量孢子囊和游動孢子，這與前人的研究結(jié)果一致。傳統(tǒng)疫霉屬卵菌的鑒定主要依據(jù)其形態(tài)特征，但難于區(qū)分形態(tài)相似的種。研究發(fā)現(xiàn)，rDNA-ITS序列在疫霉屬種內(nèi)不同菌株間高度保守，而種間序列變異豐富，為卵菌的分類鑒定提供豐富的遺傳信息[12]。因此，該研究根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析明確了邯鄲大名縣辣椒疫病的病原分類地位，為辣椒疫病的防治提供理論依據(jù)。該研究采用活體刺莖接種法進行致病力測定，結(jié)果表明，所分離的辣椒疫霉菌Bz接種到5個辣椒品種后均引起辣椒發(fā)病，顯示菌株Bz為辣椒疫病的病原菌。

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