非洲豬瘟疫苗研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)：減毒非洲豬瘟疫苗

陳權(quán)

摘 要：本文是《非洲豬瘟疫苗研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)》的第二部分，主要介紹非洲豬瘟疫苗的研究情況。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；保護性免疫；非洲豬瘟疫苗；保護性抗原

病毒的毒力依賴于多種關(guān)鍵可變因素，這些可變因素包括：病毒的毒株、病毒入侵的劑量、入侵途徑和宿主動物等。疫苗保護/效力研究基本上是對病毒毒力的評估，包括用五種可變因素的免疫接種（使用特定抗原材料/載體、劑量、途徑、免疫計劃和攻毒時間）對宿主進行預(yù)處理。重要的是，保護作用很大程度上受疫苗接種參數(shù)和在特定宿主中所有會影響病毒毒力的可變因素的影響。因此，在考慮當前非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）疫苗文獻中所述的免疫保護作用時，試驗背景尤其重要，因為研究以多種不同的方式進行。研究人員已檢測到多種非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）毒株（歐洲毒株、非洲毒株、高毒力、中等毒力、未知毒力、不同程度的組織培養(yǎng)適應(yīng)性變化、動物通道等）和不同的挑戰(zhàn)劑量和途徑（高LD50、低LD50、半致死量攻毒、肌肉內(nèi)攻毒、接觸攻毒等）。試驗宿主也是可變的，包括不同年齡、品種和條件（常規(guī)、無特定病原體動物、近交、年齡和/或體重范圍廣泛、挑戰(zhàn)時持續(xù)感染ASFV等）。最后，研究使用了一系列免疫接種方案/時間表，包括免疫接種和免疫接種評估（動物攻毒）之間的可變時期和保護評估的可變標準。鑒于我們對ASFV和ASFV感染生物學(xué)的了解有限，很難精確預(yù)測這些可變因素的生物學(xué)意義及其在ASFV感染和保護性免疫背景下相互作用的可能性。因此，在該特定的研究背景下解釋ASF免疫保護結(jié)果并推斷它們的普遍適用性至關(guān)重要。

將減毒ASF病毒（Live-attenuated ASF Virus，LAV）作為疫苗。

1 傳統(tǒng)的LAV疫苗

完整的保護性免疫力是在感染ASFV后存活的豬中誘導(dǎo)產(chǎn)生的。豬在感染ASFV中等毒力的毒株或通過傳統(tǒng)方法減弱的ASFV毒株后會對同源病毒毒株的挑戰(zhàn)產(chǎn)生長期的抵抗力，而對異源毒株的挑戰(zhàn)幾乎不產(chǎn)生抵抗力。同源病毒毒株交叉保護的范圍并不總是清晰的，因為不同的ASFV可能會誘導(dǎo)相同的防護措施，相反，看來好像有密切親緣關(guān)系的ASFV可能無法產(chǎn)生交叉保護?？偟膩碚f，由ASFV LAV產(chǎn)生的ASFV免疫保護作用缺乏臨床癥狀和病毒血癥減少的特征，病毒血癥在發(fā)病時要么不出現(xiàn)，要么延期出現(xiàn)，而且滴度明顯降低?？傊?，這些狀況可以反映豬體內(nèi)的病毒復(fù)制在早期被控制住了。

2 工程化的LAV疫苗

從理論上講，我們應(yīng)該能夠設(shè)計出安全性高和效力大的減毒ASFV，而不是用傳統(tǒng)方式產(chǎn)生的LAV病毒。Tulman和Rock、Dixon等、Chapman等、Tulman等和Corria等在對ASFV進行的比較基因組學(xué)和功能性基因組學(xué)研究中確定了與病毒毒力和宿主范圍相關(guān)的ASFV的病毒基因。含有設(shè)計缺失特異性毒力/宿主范圍基因[包括胸苷激酶（Thymidine Kinase，TK）基因、9GL（B119L）基因、NL（DP71L）基因和多基因家族360和505（Multigene Families 360 and 505，MGF 360/505）中多個基因成員]的ASFV在宿主體內(nèi)毒力減弱，且能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生針對同源親本病毒攻毒的保護性免疫反應(yīng)。這些ASFV基因推薦的毒力和宿主范圍功能很可能成為豬上基因缺失病毒減弱表型的基礎(chǔ)。缺失TK基因和9GL基因的ASFV，其毒力的弱化可能是由于這些病毒在豬巨噬細胞（體內(nèi)ASFV復(fù)制的關(guān)鍵靶細胞）中觀察到的復(fù)制明顯缺陷所致。從ASFV歐洲株E70株中缺失NL基因可在不影響病毒體外復(fù)制的情況下降低其在豬體內(nèi)的毒力，且與單純皰疹病毒ICP34.5蛋白具有共性的NL蛋白被認為可通過指導(dǎo)蛋白磷酸酶1a對真核細胞翻譯起始因子（eukaryotic translation Initiation Factor，eIF）-2a脫磷酸化來防止宿主細胞蛋白質(zhì)切斷。通過ASFV MGF 360/505基因抑制宿主體內(nèi)的I型IFN反應(yīng)可能是造成一些MGF 360/505基因缺失病毒和豬中其減弱表型觀察到的巨噬細胞生長缺陷的原因。

基因缺失對ASFV弱化和免疫原性的影響可能與毒株有關(guān)。例如，NL（DP71L）基因的缺失完全減弱了動物中的歐洲E70毒株的毒力，但對兩種非洲ASFV毒株的毒力沒有影響。此外，ASFV的馬拉維毒株和格魯吉亞毒株的毒力均因TK基因的缺失被減弱，但只有TK基因缺失的馬拉維毒株能夠誘導(dǎo)受到ASFV攻毒的動物產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。

ASFV的多重弱化突變可能會對病毒的免疫原性產(chǎn)生負面影響。Abrams等證明，當兩個與毒力相關(guān)的基因[NL（DP71L）和UK（DP96R）]從先前減弱的ASFV分離株OUR T88/3的基因中剔除時，免疫動物產(chǎn)生的保護力從100%降低到66%。同樣，從ASFV格魯吉亞分離株剔除9GL（B119L）基因和MGF 360/505基因簇，均會導(dǎo)致病毒的毒力被高度弱化，使其無法誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。有趣的是，ASFV格魯吉亞重組病毒僅缺失9GL基因簇或MGF 360/505基因簇，其在豬體內(nèi)的毒力會被徹底弱化，并且可以保護它們免受ASFV強毒性毒株格魯吉亞分離株的感染。

3 ASF LAV的安全性

LAV疫苗的安全性和有效性是有聯(lián)系的，必須在考慮影響病毒毒力的標準、特定病毒分離株、病毒的接種劑量、病毒接種途徑和所接種動物的特定背景下進行觀察和評估。研究人員已經(jīng)就試驗性ASF LAV提出了重要的安全性問題。

免疫接種后的應(yīng)答會導(dǎo)致動物發(fā)生慢性ASF。在接種ASFV葡萄牙分離株的豬中首次觀察到這種情況，該分離株在骨髓細胞培養(yǎng)基中通過連續(xù)傳代后毒力減弱。同樣，在接種了毒力自然弱化的ASFV弱毒分離株ASFV/nh/p68毒株（可能是一個由疫苗衍生的病毒）的動物中，25%～47%的動物出現(xiàn)了慢性病變并暴發(fā)疾病，其特征是遲發(fā)性發(fā)熱和病毒血癥，以及高水平的ASFV抗體和明顯的高γ球蛋白血癥。Pan等和Takamatsu等在感染ASFV的其他中等毒力分離株的豬體內(nèi)同樣也觀察到了免疫病理學(xué)癥狀——包括高γ球蛋白血癥和涉及大量巨噬細胞的全身免疫激活、激活的B細胞和CD8+ T細胞。King等在用潛在的ASF LAV疫苗候選毒株OUR T88/3毒株免疫接種動物后觀察到了接種動物出現(xiàn)不太嚴重的反應(yīng)，如發(fā)燒和關(guān)節(jié)腫脹等。

研究人員還報告了其他與環(huán)境相關(guān)的安全問題，包括病毒的毒株和免疫劑量以及宿主的變異性。包括宿主免疫和/或伴隨的協(xié)同病原體感染狀態(tài)在內(nèi)的因素似乎會影響ASFV的毒力。King等和Lacasta等描述了在常規(guī)豬中毒力減弱但在無特定病原體豬中仍保持毒力的ASFV毒力弱化的例子。此外，安全的免疫劑量可能是一個問題。對于一些毒力減弱的ASFV，安全劑量和毒性劑量之間的差異似乎很小，并且存在ASFV毒株依賴性。

4 ASF LAV概要

有效性、殘留致病性和病毒長期持續(xù)存在等問題使人們對目前的試驗性LAV疫苗候選株適合在任何情況下的使用提出了重大疑問。然而，在ASFV比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)上取得的研究進展已經(jīng)提高了人們對會影響病毒毒力和宿主范圍的特殊基因的了解，這些信息已經(jīng)為理性設(shè)計高效的ASF LAV并提高疫苗的安全性做好了準備。目前的挑戰(zhàn)仍然是確定減毒突變株的一個特定補體，以便讓突變株能夠在不同的ASFV基因背景下發(fā)揮作用，同時可在不損害保護性病毒免疫原性的情況下最大限度地提高安全性。免疫病理后遺癥是LAV疫苗設(shè)計時需要考慮的重點。由于我們不了解ASF LAV免疫病理學(xué)的機制和病毒宿主之間的相互作用，因此在評估潛在的LAV疫苗候選株安全性時需要非常小心。而且，盡管我們尚不清楚ASFV持續(xù)感染和感染后遺癥對建立強有力的持久保護性免疫的重要性，但可想而知的是持久性是評估LAV疫苗應(yīng)考慮的一個因素。具體來說，ASF LAV 提供的保護（在目標細胞 或宿主反應(yīng)水平上）是否涉及任何由病毒持 續(xù)感染引起的干擾機制？□□

原題名：Challenges for African swine fever vaccine development—“perhaps the end of the beginning”（英文）

原作者：D. L. Rock（美國伊利諾伊大學(xué)）