C反應(yīng)蛋白對巨噬細(xì)胞分泌趨化因子CXCL16影響的研究

陳靜文 王審 林冬銘 黃抒偉

冠心病的發(fā)病機制一直是研究熱點。近年新發(fā)現(xiàn)的CXC趨化因子配體16（CXCL16）既具有趨化因子的功能，同時還可作為清道夫受體吞噬氧化的低密度脂蛋白，促進泡沫細(xì)胞形成[1］，此外CXCL16還有促進平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞與細(xì)胞間黏附，刺激血管生成的作用[2］。C反應(yīng)蛋白（CRP）是一個最強的獨立于血脂預(yù)測作用的心血管疾病預(yù)測因子。CRP參與急性冠脈綜合征形成和進展的各個階段，包括內(nèi)皮功能異常、內(nèi)皮活化、斑塊形成及斑塊破裂等[3］。Han等[4］體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，重組人CRP可上調(diào)單核細(xì)胞中CC趨化因子受體2的表達(dá)，促進由單核細(xì)胞趨化因子-1介導(dǎo)的對單核細(xì)胞的趨化作用。而同為趨化因子家族成員的CXCL16，是否與CRP存在某些聯(lián)系？目前國內(nèi)外較少這方面的研究，本文通過體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，在藥物誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，檢測在CRP干預(yù)下巨噬細(xì)胞分泌CXCL16水平的變化情況，探討這兩種炎性標(biāo)志物之間的關(guān)系，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞所提供；主要試劑:重組人CRP（德國Merck公司）；CXCL16ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；FBS（杭州四季青公司）；佛波醇（美國sigma公司）；改良型RPMI1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；總RNA提取劑TRIZOL Reagent（美國invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）；CXCL16引物及內(nèi)參（由上海生工公司設(shè)計）。CXCL16引物:上游引物5’-ACTCAGCCA GGCAATGGCAAC-3’；下游引物 5’-GGTATTAGAG TCAGGTGCCAC-3’；擴增片段長度為693bp。擴增內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因:上游引物 :5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’； 下 游 引物:5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’；擴增片段長度:350bp。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) 將THP-1細(xì)胞與10ml含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液加至培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃溫箱中，飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，待培養(yǎng)液發(fā)黃后1～2d傳代，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)至活細(xì)胞數(shù)達(dá)5×106個/ml時，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，共接種25個孔，每孔接種3ml細(xì)胞液，給予佛波醇（60ng/ml）處理24～48h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)形狀不規(guī)則且貼壁生長，即為誘導(dǎo)成功[5］，開始計時。

1.2.2 ELISA法檢測CXCL16水平 無菌管收集5個時間點（6、12、24、48、72h）巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后取上清液置于-80℃冰箱中備用。采用ELISA法檢測5個時間點細(xì)胞上清液CXCL16水平。

1.2.3 CRP干預(yù)實驗 （1）將誘導(dǎo)成功的巨噬細(xì)胞分為 5 組，分別加入 0、5、10、20、50μg/ml CRP 至培養(yǎng)孔共同孵育。至巨噬細(xì)胞分泌CXCL16水平最高的時間點時收集上清液，采用ELISA法檢測CXCL16水平。（2）RT-PCR:提取5組巨噬細(xì)胞RNA，各管取5μlRNA放入EP管中，70℃水浴箱中孵育10min，進行基因擴增，反應(yīng)條件為25℃5min、42℃60min、70℃ 5min、99℃ 10min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μl置于 EP 管中，順序加入:氯化鎂（1.5μl）、10×反應(yīng)液（2.5μl）、無核酸酶水（16.75μl）、三磷酸脫氧核苷酸混合溶液（0.5μl）、上游引物（0.75μl）、下游引物（0.75μl）、DNA 聚合酶（0.25μl）。設(shè)置 PCR 反應(yīng)條件為:94℃3min預(yù)變性，94℃30s變性，58℃30s退火，72℃45s延伸，34個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μl擴增產(chǎn)物與1μl 6×反應(yīng)液混合后用10g/L的瓊脂糖凝膠恒壓100V電泳30min，利用紫外分析儀對電泳結(jié)果進行觀察并拍照。對PCR電泳結(jié)果進行灰度值掃描并半定量分析。計算5組CXCL16與相應(yīng)的內(nèi)參GAPDH基因PCR產(chǎn)物的灰度值之比，比較5組CXCL16基因mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THP-1誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞后不同時間點分泌CXCL16水平情況 見圖1。

圖1 THP-1誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞后不同時間點分泌CXCL16水平情況

由圖 1 可見，6、12、24、48、72h 分泌 CXCL16 水平分別為:（52.911±6.802）、（168.635±13.051）、（506.597±18.853）、（325.459±13.850）、（166.979±12.358）ng/L。12h與72h比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；其余時間點兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。5個時間點中，24h為CXCL16分泌水平高峰。

2.2 5組巨噬細(xì)胞分泌CXCL16水平比較 見圖2。

由圖2可見，5組巨噬細(xì)胞分泌CXCL16水平分別為:（518.363±12.438）、（641.161±13.438）、（825.002±15.186）、（1129.026±16.853）、（1611.443±19.962）ng/ml。組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.3 5組巨噬細(xì)胞CXCL16基因RT-PCR電泳結(jié)果及mRNA的相對表達(dá)水平比較 見圖3。

圖2 5組巨噬細(xì)胞分泌CXCL16水平比較

圖3 5組巨噬細(xì)胞與不同濃度CRP共同孵育后，CXCL16基因、內(nèi)參GAPDH基因RT-PCR電泳結(jié)果及mRNA的相對表達(dá)水平比較（A:CXCL16基因PCR電泳照片；B:內(nèi)參GAPDH基因PCR電泳照片；C:5組CXCL16與內(nèi)參GAPDH基因PCR產(chǎn)物灰度值之比）。

由圖 3可見，5組 CXCL16與 GAPDH基因PCR產(chǎn)物灰度值之比分別為:0.120±0.011、0.230±0.015、0.502±0.021、0.808±0.015、1.082±0.008，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。隨著CRP干預(yù)劑量的增加，巨噬細(xì)胞分泌CXCL16的水平和CXCL16mRNA的表達(dá)呈劑量依賴性增加。

3 討論

動脈粥樣硬化不僅是簡單的脂質(zhì)堆積，其中涉及到內(nèi)皮功能、炎癥因子以及多種血液因素之間的相關(guān)作用，炎癥反應(yīng)貫穿于粥樣硬化斑塊的形成、演變以及破裂的整個病理過程[6］。炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)環(huán)境中的細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等的相互作用極其復(fù)雜，而趨化因子則是聯(lián)系炎癥與動脈粥樣硬化發(fā)生的樞紐。CXCL16作為與動脈粥樣硬化相關(guān)的重要炎癥因子，目前的臨床研究很多， Ma等[7］對227例急性缺血性卒中患者臨床研究發(fā)現(xiàn)，血清CXCL16水平與發(fā)生動脈粥樣硬化性腦卒中密切相關(guān)。Lehrke等[8］檢測了464例冠心病患者及235例正常人的血清CXCL16水平，結(jié)果也顯示冠心病患者CXCL16水平明顯高于正常人，尤其是急性冠脈綜合征患者。目前國內(nèi)外關(guān)于CXCL16與動脈粥樣硬化相關(guān)的多種炎癥因子關(guān)系的研究甚少，許多作用機制和途徑仍有待進一步研究證實。

本實驗之所以選擇THP-1細(xì)胞來進行研究，是由于該種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成熟，且誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞的條件可靠，簡單易行。而選擇了CRP作為干預(yù)因素，是因為它是冠心病的發(fā)病機制中具有重要地位的一種急性期蛋白。盡管最初認(rèn)為CRP僅僅作為血管炎癥的一個標(biāo)志物在動脈粥樣硬化斑塊的形成中發(fā)揮作用，但最近的研究已證明:它還可以起到更為主動的作用。它可以直接參與到病變的形成、斑塊的破裂以及血栓的生成中，可以促進單核細(xì)胞的聚集、浸潤到血管壁內(nèi)，并發(fā)展為泡沫細(xì)胞，在動脈粥樣硬化斑塊部位可以發(fā)現(xiàn)有CRP沉積在血管壁上。Minako等[9］研究發(fā)現(xiàn)將一定濃度的CRP與人血管內(nèi)皮細(xì)胞孵育后可刺激IL-18的分泌，提示冠心病患者循環(huán)血中的CRP可能通過上調(diào)IL-18而產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，而目前認(rèn)為IL-18又可上調(diào)CXCL16的分泌，這就將CRP與CXCL16相聯(lián)系起來。大規(guī)模的人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性心絞痛患者血清CRP濃度≥5μg/ml，而急性冠脈綜合征患者則≥10μg/ml[10］。因而實驗組選擇了 5、10、20、50μg/ml作為 CRP 的干預(yù)劑量。實驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)隨著加入CRP劑量的增加，巨噬細(xì)胞分泌CXCL16的水平及CXCL16mRNA表達(dá)也上調(diào)?；隗w外細(xì)胞培養(yǎng)水平，此次研究闡明了CRP與CXCL16之間存在相關(guān)性:CRP可作用于巨噬細(xì)胞，刺激CXCL16的表達(dá)，提示在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中，這兩種具有代表性的重要炎癥因子之間存在著相互作用。

雖然目前CRP和CXCL16之間具體作用機制尚不清楚，但已經(jīng)有一些相關(guān)的實驗室研究提供了方向和思路。在一項關(guān)于心血管疾病與慢性阻塞性肺病相關(guān)的炎癥反應(yīng)發(fā)生機制的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，吸煙可通過增強血管內(nèi)皮細(xì)胞Nox5的表達(dá)、RhoA/p38 MAPK/NF-κB信號通路激活從而上調(diào)CXCL16的表達(dá)[11］。在臨床上，我們發(fā)現(xiàn)部分動脈粥樣硬化患者盡管接受了嚴(yán)格生活方式指導(dǎo)以及最優(yōu)化的藥物治療，內(nèi)環(huán)境中的炎癥及免疫反應(yīng)仍然持續(xù)存在，導(dǎo)致疾病反復(fù)甚至進展[12］。Ridker等[13］報道了CANTOS研究的初步結(jié)果，所有入選患者均診斷“急性心肌梗死”并且伴有超敏CRP升高，隨機分為兩組，分別及接受Canakinumab（人白細(xì)胞介素-1β的單克隆抗體，目前已被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床風(fēng)濕疾病的治療）及安慰劑治療3個月。與安慰劑組比較，Canakinumab組超敏CRP明顯降低，且呈劑量依賴性，同時并不降低外周血的LDL-C水平。3個月后Canakinumab組一級終點事件（非致死性心肌梗死、非致死性卒中、心血管死亡）發(fā)生率更低。CANTOS研究更進一步證實了冠心病的炎癥假說。在信號通路方面，Wenlin等[14］發(fā)現(xiàn)他汀在冠心病患者治療過程中通過抑制IL-1β和NF-κB信號通路來發(fā)揮其抗炎作用。在本實驗研究基礎(chǔ)上還可以繼續(xù)探討CRP影響CXCL16表達(dá)的作用途徑并可實施藥物干預(yù)實驗，為動脈粥樣硬化性心血管疾病的治療提供新的思路及靶點。