黑加侖酵素有機(jī)酸分析及其體外抗氧化性能研究

樊秋元，朱 丹，牛廣財(cái)*，魏文毅，劉 鑫，張 琪

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黑加侖學(xué)名黑穗醋栗（Ribes nigrum L.），又稱紫梅或黑豆果，成熟果實(shí)為小漿果，味酸甜、多汁。常見于我國(guó)黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、青海、新疆等地區(qū)[1]。黑加侖果實(shí)中含有豐富的花色苷、多糖、有機(jī)酸、多酚類物質(zhì)、氨基酸及鈣、磷、鐵、銅、鋅、錳、鎂等多種礦物質(zhì)元素，其中花色苷可以保護(hù)視力。由于黑加侖可預(yù)防高血壓、心臟病，具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等功效，因此具有較高的市場(chǎng)價(jià)值和開發(fā)潛力[2]。

酵素是使用水果、蔬菜、菌類以及食用性藥材為原料，經(jīng)過有益菌發(fā)酵后而得到的，含有豐富的酶類、維生素、礦物質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物等的功能性微生物發(fā)酵保健性食品[3-4]。酵素具有抗疲勞、抗衰老、清除自由基等功能[5]。通過有益微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酵素中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量增多，具有較好的抗氧化能力。SOD能夠清除羥基自由基（OH·）、超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫等活性氧（reactive oxygen species，ROS），是細(xì)胞防御系統(tǒng)中的主要抗氧化酶[6]。黑加侖酵素是以黑加侖果為原料，白砂糖為輔料，經(jīng)過多種有益菌發(fā)酵制得的富含多種生物活性物質(zhì)和有多種微生物次生代謝產(chǎn)物的發(fā)酵水果飲品[7]。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的酵素多數(shù)采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝，盡管發(fā)酵周期較長(zhǎng)，在2個(gè)月～1年不等。但是在工藝條件控制良好的情況下，自然發(fā)酵酵素的風(fēng)味較好，一般不會(huì)有食用的安全風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)已被廣大消費(fèi)者所接受。酵素的自然發(fā)酵過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的復(fù)雜的混合菌發(fā)酵過程，由于多種微生物的作用，發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種有機(jī)酸，有機(jī)酸不僅賦予酵素特有的風(fēng)味和口感，還能較強(qiáng)地維護(hù)人體腸道功能和抗氧化性能[8]。研究表明，人類的多種疾?。ㄈ缪装Y、糖尿病、腫瘤等）與機(jī)體中過量的自由基有關(guān)，天然酵素具有較好的抗氧化性能，凈化血液，修復(fù)細(xì)胞組織，可清除人體內(nèi)多余的自由基，減輕其對(duì)人類機(jī)體的傷害[9-10]。

國(guó)內(nèi)已有果蔬酵素制備的相關(guān)報(bào)道，主要研究了藍(lán)莓酵素、葡萄酵素、西蘭花酵素和蘋果酵素等食用植物酵素[3，9-11]。但是，目前尚未見到黑加侖酵素的相關(guān)研究報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)以黑加侖自然發(fā)酵酵素為研究對(duì)象，測(cè)定其相關(guān)指標(biāo)，并采用高效液相色譜（highperformanceliquid chromatography，HPLC）法測(cè)定酵素中有機(jī)酸的種類和含量，同時(shí)，以1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基、2,2"-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2"-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS+）自由基清除能力和還原力為抗氧化性指標(biāo)，考察其體外抗氧化性能，以期為黑加侖酵素綜合性開發(fā)提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖、白砂糖：市售；福林酚：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SOD酶活力檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）：南京建成生物工程研究所；三羥甲基氨基甲烷：上海源葉生物科技有限公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；磷酸、磷酸二氫鉀（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；甲醇（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、無水碳酸鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、過氧化氫、硫酸亞鐵、冰乙酸、維生素C等（均為分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；DPPH（分析純）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WS108手持式折光儀：河北潤(rùn)聯(lián)科技開發(fā)有限公司；HR7633打漿機(jī)：飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；EX324電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；DL-CJ-1N超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；TD5Z低速平衡離心機(jī)：金壇市城西春蘭試驗(yàn)儀器廠；UV-1100紫外可見分光光度計(jì)：上海凌析達(dá)儀器有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Agilent1200高效液相色譜：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑加侖自然發(fā)酵酵素的制備

用無菌水在無菌條件下多次輕輕沖洗黑加侖果，除去其表面沙子和灰塵后在無菌操作臺(tái)中瀝水、自然晾干。白砂糖用紫外燈殺菌60 min，將黑加侖與白砂糖按質(zhì)量比1∶1（W/W）加入已滅過菌的磨砂口玻璃瓶中，密封瓶口。為了避免可能的菌體污染，在制備黑加侖酵素過程中，所有操作均在無菌條件進(jìn)行[12]。瓶塞處安裝好發(fā)酵栓后，將玻璃瓶放在避光處，室溫條件下發(fā)酵225 d。發(fā)酵結(jié)束后取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 主要產(chǎn)品指標(biāo)測(cè)定

感官檢驗(yàn)：取50 mL樣品于干燥潔凈的樣品杯中，置于非直射日光下，目測(cè)觀察外觀及色澤；嗅其氣味；溫開水漱口后，用舌尖品嘗其滋味[13]。

總酸：根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定方法》[14]進(jìn)行測(cè)定。

菌落總數(shù)：根據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)》[15]進(jìn)行測(cè)定。

大腸菌群：根據(jù)GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[16]進(jìn)行測(cè)定。

沙門氏菌：根據(jù)GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》[17]進(jìn)行測(cè)定。

金黃色葡萄球菌：根據(jù)GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[18]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 有機(jī)酸含量測(cè)定

Agilent1200高效液相色譜檢測(cè)條件[10]：色譜柱為Supersil AQ-C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相：0.02 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸調(diào)pH 2.80）；液相條件：等梯度洗脫10 min；流速1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。樣品用超純水稀釋10倍，用0.22 μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

準(zhǔn)確稱取酒石酸10 mg，用超純水溶解定容于10 mL容量瓶中，搖勻，即為1 mg/mL酒石酸標(biāo)準(zhǔn)液，相同的方法配制草酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為0.1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、0.1 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL，以有機(jī)酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)酵素樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析。

1.3.4 體外抗氧化性能的測(cè)定

DPPH清除能力的測(cè)定：將3μL、6μL、9μL、12μL、15μL發(fā)酵樣品分別加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液中，再加入450 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4），25 ℃恒溫水浴30 min。以去離子水為參比溶液，以4 mg/mL的VC為對(duì)照[19]。在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A0為空白對(duì)照液吸光度值；A1為樣品測(cè)定管吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

羥基自由基清除能力的測(cè)定：分別取10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL發(fā)酵液，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、FeSO4溶液，搖勻靜置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，37℃恒溫水浴1 h，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，以去離子水為參比溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0，以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2[20]。以4 mg/mL的VC為對(duì)照，按下式計(jì)算羥基自由基清除能力，計(jì)算IC50：

ABTS+自由基清除能力的測(cè)定：分別取1μL、2μL、3μL、4 μL、5 μL發(fā)酵液，根據(jù)ABTS法總抗氧化能力試劑盒說明書進(jìn)行ABTS+自由基清除能力的測(cè)定。以4 mg/mL的VC為對(duì)照，計(jì)算IC50。

還原力測(cè)定：將5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL發(fā)酵液分別加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6），然后加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50℃反應(yīng)30 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min離心10 min，立即取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵。以去離子水為參比溶液，以4 mg/mL的VC為對(duì)照，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值[21]，計(jì)算IC50。吸光度值越高，還原力越強(qiáng)。

1.3.5 黑加侖酵素總抗氧化能力的測(cè)定

將黑加侖酵素液3 500 r/min離心10 min后，取上清液，根據(jù)總抗氧化能力試劑盒說明書進(jìn)行總抗氧化能力的測(cè)定。

1.3.6 黑加侖酵素SOD酶活力的測(cè)定

將黑加侖酵素液3 800 r/min離心10 min后，取上清液，根據(jù)SOD酶試劑盒說明書進(jìn)行SOD酶活力的測(cè)定。

1.3.7 花色苷含量的測(cè)定

分別移取1 mL樣液2份，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液定容至10 mL。置于暗處平衡2 h，以空白樣（取1 mL蒸餾水，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液定容至10 mL）作對(duì)照，用分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)510 nm和700 nm處測(cè)定吸光度值[22]。每個(gè)樣品處理重復(fù)3次，取平均值。

花色苷含量計(jì)算公式如下：

式中：A為吸光度值；MW為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；DF為稀釋因子；V為最終體積，mL；ε為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；L為光程，1 cm；m為產(chǎn)品重量，mg。

A=（A510nmpH 1.0-A700nmpH 1.0）-（A510nmpH 4.5-A700nmpH4.5）；用A700nm消除樣液渾濁的影響。

1.3.8 總多酚含量的測(cè)定

配制一系列濃度的沒食子酸，加入顯色劑后在波長(zhǎng)765nm處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.1792x+0.0887，R2=0.9986。稱取1mL樣品，加入蒸餾水至10mL，3000r/min離心10 min后，取其上清液，稀釋50倍。再取稀釋后的樣液1 mL加入1 mL FC（福林酚）顯色劑及3 mL 20%Na2CO3，混勻，于50℃水浴反應(yīng)30min。在波長(zhǎng)765nm處測(cè)定吸光度值[23]，計(jì)算總多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑加侖自然發(fā)酵酵素的產(chǎn)品指標(biāo)

表1 黑加侖酵素的品質(zhì)指標(biāo)Table 1 Quality indexes of blackcurrant Jiaosu

由表1可知，發(fā)酵結(jié)束后的黑加侖酵素經(jīng)過過濾得到的液態(tài)產(chǎn)品均勻粘稠，色澤呈有光澤的玫紅色，口味較甜，略有點(diǎn)酸，具有獨(dú)特的黑加侖香氣和果香。酵素的總酸（以乳酸計(jì)）含量為2.65 g/100 mL，總抗氧化能力值為614.20 U/mL，SOD酶活力為1 998.30 U/g，總花色苷含量為6.63 mg/100 mL，總多酚含量為8.45 mg/mL；菌落總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸菌群數(shù)≤10 CFU/mL，致病菌：未檢出。所以，本實(shí)驗(yàn)研究的自然發(fā)酵黑加侖酵素是一種符合T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》標(biāo)準(zhǔn)的健康飲品，不存在食用的安全風(fēng)險(xiǎn)[13]。

2.2 黑加侖酵素有機(jī)酸種類及含量分析

8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品及黑加侖酵素有機(jī)酸高效液相色譜圖見圖1，8種有機(jī)酸種類和含量見表2。由圖1可知，8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果很好，以各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，采用外標(biāo)法測(cè)定黑加侖酵素有機(jī)酸種類和含量。黑加侖酵素自然發(fā)酵過程是一個(gè)復(fù)雜的多種菌類混合發(fā)酵體系，所以酵素中有機(jī)酸會(huì)隨著發(fā)酵菌的代謝和生長(zhǎng)而發(fā)生變化。由表2可知，黑加侖酵素有機(jī)酸以檸檬酸（1 567.27 mg/L）、蘋果酸（220.01 mg/L）、草酸（110.01mg/L）和奎寧酸（93.73mg/L）為主，同時(shí)因發(fā)酵代謝積累了莽草酸（14.58 mg/L）。有機(jī)酸是酵素發(fā)酵過程中改變其風(fēng)味的重要因素，研究表明，果蔬發(fā)酵代謝中積累了少量丙酮酸、富馬酸和莽草酸，其中莽草酸是多種有機(jī)酸代謝過程的重要產(chǎn)物[24]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸（A）和黑加侖酵素有機(jī)酸（B）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of organic acid standards(A)and organic acid from blackcurrant Jiaosu(B)

表2 黑加侖酵素有機(jī)酸種類和含量Table 2 Species and contents of organic acid from blackcurrant Jiaosu

2.3 黑加侖酵素的DPPH自由基清除能力

黑加侖酵素DPPH自由基清除能力如圖2所示。由圖2可知，黑加侖酵素DPPH自由基清除能力表現(xiàn)出較強(qiáng)的濃度依賴性，隨著樣品用量的增加，DPPH清除能力近似梯度增加。黑加侖酵素的DPPH自由基清除能力從42.95%增至88.50%，對(duì)照品VC在3～9 μL范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力隨著樣品添加量的增加而快速增加，當(dāng)用量＞9 μL之后接近平衡。經(jīng)過計(jì)算，黑加侖酵素的IC50為5.18 mg VC當(dāng)量/mL。

圖2 黑加侖酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of blackcurrant Jiaosu

2.4 黑加侖酵素對(duì)羥基自由基（·OH）清除能力

圖3 黑加侖酵素對(duì)羥基自由基（·OH）清除能力Fig.3 Hydroxyl free radical(·OH)scavenging ability of blackcurrant Jiaosu

由圖3可知，黑加侖酵素對(duì)羥基自由基清除能力優(yōu)于VC對(duì)照，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黑加侖酵素對(duì)羥基自由基清除能力從61.47%增至92.08%，而當(dāng)VC用量＞20 μL后，對(duì)照品VC的羥基自由基清除能力趨于穩(wěn)定，達(dá)到54.90%。經(jīng)計(jì)算，黑加侖酵素的IC50為1.43mgVC當(dāng)量/mL。

2.5 黑加侖酵素對(duì)ABTS+自由基清除能力

圖4 黑加侖酵素對(duì)ABTS+自由基清除能力Fig.4 ABTS+free radical scavenging ability of blackcurrant Jiaosu

由圖4可知，黑加侖酵素對(duì)ABTS+自由基清除能力也表現(xiàn)出良好的濃度依賴性，其自由基清除能力略低于4 mg/mL的對(duì)照品VC，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黑加侖酵素對(duì)ABTS+自由基清除能力從0.56 mmol/L增加至0.92 mmol/L，經(jīng)過計(jì)算，黑加侖酵素的IC50為20.28 mg VC當(dāng)量/mL。

2.6 黑加侖酵素還原能力

圖5 黑加侖酵素還原能力Fig.5 Reducing power of blackcurrant Jiaosu

由圖5可知，黑加侖酵素還原能力總體略低于對(duì)照品VC。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黑加侖酵素的還原力從0.285增加至0.927，當(dāng)樣品用量＞15μL之后，黑加侖酵素還原力接近平衡。經(jīng)過計(jì)算，黑加侖酵素的IC50為39.06mg VC當(dāng)量/mL。

3 結(jié)論

黑加侖經(jīng)自然發(fā)酵而得到的酵素產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)良好，具有較為豐富的有機(jī)酸和較好的抗氧化性能。由高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸表明，黑加侖酵素中有機(jī)酸以檸檬酸（1 567.27 mg/L）、蘋果酸（220.01 mg/L）、草酸（110.01 mg/L）和奎寧酸（93.73 mg/L）為主，同時(shí)因發(fā)酵代謝積累了莽草酸（14.58 mg/L）。抗氧化活性研究表明，黑加侖酵素對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、還原力和ABTS+自由基的清除能力均表現(xiàn)出濃度依賴性，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，黑加侖酵素對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為5.18 mg VC當(dāng)量/mL，對(duì)羥基自由基清除能力的IC50為1.43 mg VC當(dāng)量/mL，還原力的IC50為39.06 mg VC當(dāng)量/mL，對(duì)ABTS+自由基清除能力的IC50為20.28 mg VC當(dāng)量/mL。因此，以黑加侖為原料，經(jīng)自然發(fā)酵而產(chǎn)生的黑加侖酵素，具有優(yōu)良的口感，豐富的有機(jī)酸和抗氧化性能，是一種具有市場(chǎng)潛力的功能飲品，本研究可為進(jìn)一步開發(fā)黑加侖酵素功能性產(chǎn)品提供試驗(yàn)依據(jù)。