南山牧場牛乳中具有抑菌活性乳酸菌的篩選及鑒定

吳詩敏，雷文平，2，周 輝，2，游善兵，吳 霓，宋艷菲，劉成國，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.湖南南山牧業(yè)有限公司，湖南 城步 422599）

隨著消費(fèi)者食品安全意識(shí)的增強(qiáng)，研究開發(fā)安全的生物性抑菌劑具有十分重要的意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，某些乳酸菌菌株具有抑菌活性，能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，抑制各種致病菌的生長，可作為天然的生物防腐劑用于食品中，提高食品品質(zhì)，保障食品的安全性[1]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）為一般認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）微生物，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[2-3]。其中，乳酸乳球菌（Lactococcal lactis）是乳酸菌的一個(gè)重要菌屬，廣泛應(yīng)用于乳制品，已被列入歐洲食品安全局建立的安全資格認(rèn)證（qualified presumption of safety，QPS）清單[4]。辛靈瑩[5]從乳酸乳球菌發(fā)酵液中成功提取出具有抗氧化能力的胞外多糖，該胞外多糖可提高小鼠血液和主要臟器的抗氧化酶活性，對衰老小鼠有很好的保護(hù)作用。研究表明，某些乳酸乳球菌可產(chǎn)乳酸菌素，即此類細(xì)菌代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其除了具有能被人體內(nèi)的蛋白酶降解、不在體內(nèi)蓄積等優(yōu)點(diǎn)之外，還具有較好的穩(wěn)定性及適合工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，因而在開發(fā)食品天然防腐劑領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。倪萍等[8]從土壤中分離出一株具有較寬抑菌譜的乳酸乳球菌，對冷卻豬肉具有明顯的保鮮效果，可顯著減少其腐臭味。目前國內(nèi)針對乳酸菌菌種的篩選主要集中在平原牧場或北方高原地區(qū)，而對中國南方高海拔地區(qū)具有抑菌性的乳酸乳球菌的研究報(bào)道較少。

湖南南山牧場被譽(yù)為“南方的呼倫貝爾”，為亞熱帶山地季風(fēng)濕潤氣候，夏無酷暑，冬無嚴(yán)寒，空氣新鮮，土壤、大氣、水質(zhì)無任何污染和公害，極適宜微生物生長繁殖[9]。本研究擬從湖南省南山牧場的鮮奶中分離篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，采用形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對菌株進(jìn)行鑒定，并對細(xì)菌素的成分及pH、溫度、NaCl耐受性進(jìn)行研究，旨在分離篩選出能在食品中添加的，具有抑菌作用的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鮮牛奶：南山牧業(yè)有限公司不同擠奶站的貯藏罐；李斯特菌（Listeria）：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

M17固（液）體培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（2 000～5 000 U/mg）：上海瑞永生物科技有限公司；胃蛋白酶（3000～3500U/g）、胰蛋白酶（≥50000U/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶（≥800 U/mg）：上海陸廣生物科技有限公司；堿性蛋白酶（≥200 U/mg）：江蘇銳陽生物科技有限公司；NaOH、NaCl、磷酸鹽緩沖液：均為國產(chǎn)分析純試劑；革蘭氏染色液：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒、pfu高保真聚合酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：蘇州凈化有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫(yī)療器械廠；601超級(jí)恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；牛津杯（內(nèi)徑6.0 mm、外徑7.8 mm、高10.0 mm）：上海新睿生物科技有限公司；Tprofessional standard 96 Gradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；BH-2光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

在無菌的條件下，取25 mL鮮牛奶樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻，以10倍系列稀釋，稀釋度為10-1～10-6。分別取不同稀釋度的稀釋液涂布于M17固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。挑取典型乳酸菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色，選取革蘭氏陽性菌，分別接種于裝有5 mL M17液體培養(yǎng)基的試管中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，將乳酸菌編號(hào)后于M17固體培養(yǎng)基上三代劃線純化，保存待用。

1.3.2 具有抑菌特性乳酸菌的分離篩選

將劃線純化后保存的菌株接種于裝有5 mL M17液體培養(yǎng)基的試管中，37℃靜置培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心3 min，取上清液。

采用牛津平板法測定菌株是否具有抑菌活性[10]：將活化后的李斯特指示菌與加熱融化的固體培養(yǎng)基混勻，使菌落終濃度至107CFU/mL，傾注約15 mL于無菌平皿中，待培養(yǎng)基凝固后，放入牛津杯，取200 μL上清液加入牛津杯，4℃條件下擴(kuò)散4 h后，37℃條件下培養(yǎng)10 h，觀察抑菌圈。采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，以未接種的培養(yǎng)基上清液作為空白對照，重復(fù)3次。當(dāng)抑菌圈直徑≥4.0 mm視為有抑菌作用[11-13]。

1.3.3 具有抑菌特性乳酸菌的鑒定

形態(tài)觀察：將篩選后得到的菌株接種于M17固體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：挑選具有抑菌特性的菌株接種于M17液體培養(yǎng)基，在37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，取菌液1 mL，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，收集菌體。采用DNA提取試劑盒提取DNA，以其為模板，對菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1μL，pfu Buffer 5μL，pfu酶0.25μL，加雙蒸水（ddH2O）至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性5min；95℃變性35 s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸4 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測[14]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast搜索，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA5.0中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 抑菌物質(zhì)成分的初步鑒定

為進(jìn)一步確定菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的成分，發(fā)酵液經(jīng)離心后，采用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)上清液的pH至6.5～7.0，經(jīng)0.22μm濾膜過濾去除菌體及雜質(zhì)，得到無細(xì)胞發(fā)酵上清液。將無細(xì)胞發(fā)酵上清液通過以下幾種方式進(jìn)行處理：上清液中加入終質(zhì)量濃度為5.0mg/mL的過氧化氫酶，于30℃水浴鍋中溫浴2 h，進(jìn)行滅酶處理[15]；向上清液中分別加入終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至各酶的最適作用范圍，30℃水浴2 h后取出，再將pH調(diào)至6.5～7.0，確定其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)是否為多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

取200 μL上述處理后的發(fā)酵上清液于牛津杯中，測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次。

1.3.5 pH對抑菌物質(zhì)活性的影響

采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)上清液pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾去除菌體及雜質(zhì)后，以不同pH條件下未處理的無細(xì)胞發(fā)酵上清液作為空白對照，通過牛津杯平板法檢測不同pH值作用后上清液的抑菌活性[16]。

1.3.6 溫度對抑菌物質(zhì)活性的影響

發(fā)酵上清液分別在37℃、60℃、80℃、100℃、121℃的溫度條件下處理20 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾去除菌體及雜質(zhì)后，以25℃放置20 min處理的無細(xì)胞發(fā)酵上清液作為空白對照，冷卻后通過牛津杯平板法檢測不同溫度處理后上清液的抑菌活性。

1.3.7 抑菌物質(zhì)耐鹽性的測定

發(fā)酵上清液中分別加入體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%、10%的1mol/LNaCl溶液，30℃水浴2h后取出，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾去除菌體及雜質(zhì)后，以不加NaCl的無細(xì)胞發(fā)酵上清液作為空白對照，通過牛津杯平板法檢測不同濃度鹽處理后上清液的抑菌活性。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±S）表示。運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05水平為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮牛奶中乳酸菌的分離結(jié)果

鮮牛奶樣品中乳酸菌的分離結(jié)果見表1。

表1 乳酸菌的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of lactic acid bacteria

由表1可知，從3個(gè)不同奶站的鮮牛奶樣品中共分離得到28株乳酸菌，其中從雞爪坪奶站分離出9株、比武沖奶站分離出11株、種牛隊(duì)奶站分離出8株。分別編號(hào)為A11～A19、B11～B21、C11～C18。

2.2 具有抑菌活性乳酸菌的篩選結(jié)果

采用牛津杯平板法測定28株乳酸菌對李斯特菌的抑制效果，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株A13、A18、B12、B16、B18、C11、C15均具有抑菌圈，其中菌株C15的抑菌圈直徑最大，為6.17 mm，對李斯特菌的抑制效果最好。因此，選擇菌株C15作為后續(xù)試驗(yàn)所用菌。

表2 具有抑菌活性乳酸菌的篩選結(jié)果Table 2 Screening results of lactic acid bacteria with bacteriostatic activity

2.3 菌株C15的鑒定

2.3.1 菌株C15的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株C15的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌株C15的菌落（A）和細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.1 Colonial(A)and cell(B)morphology of strain C15

由圖1A可知，菌株C15的菌落呈圓形凸起狀、中等大小、微白色、表面光滑、邊緣整齊、直徑為（3±1）mm，菌落背面為黃色；由圖1B可知，菌株C15的細(xì)胞為球形或卵圓形，單生或成對出現(xiàn)，成鏈狀或無鏈狀，革蘭氏染色結(jié)果為陽性，因此，初步判定菌株C15為乳球菌屬（Lactococcus）。

2.3.2 菌株C15的分子生物學(xué)鑒定

以菌株C15的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度約1 409 bp，與目的堿基長度一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，菌株C15與乳酸乳球菌（Lactococcal lactis）聚于一支，同源性達(dá)99%。因此，結(jié)合菌株C15的形態(tài)特征，將菌株C15鑒定為乳酸乳球菌（Lactococcal lactis）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株C15的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain C15 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 抑菌物質(zhì)成分的初步確定結(jié)果

乳酸菌發(fā)酵上清液對李斯特菌有抑制作用，其抑菌活性物質(zhì)可能是代謝合成的細(xì)菌素；也可能是酸性末端產(chǎn)物如乙酸、乳酸和其他有機(jī)酸的干擾；乳酸菌代謝產(chǎn)生的過氧化氫也可以抑制細(xì)菌的生長，尤其是抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的生長[17]。因此，需對菌株C15所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)成分進(jìn)行確定。上清液分別經(jīng)不同處理后的抑菌效果見表3。

表3 抑菌物質(zhì)成分初步鑒定結(jié)果Table 3 Preliminary identification results of bactericidal substance components

由表3可知，與無處理組（6.17 mm）相比，菌株C15發(fā)酵上清液在調(diào)pH至中性以及去除H2O2后，其抑菌直徑無明顯變化（P＞0.05），說明酸和H2O2不是起主要抑菌作用的因素；經(jīng)過胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后，菌株C15發(fā)酵上清液失去抑菌活性，說明上述兩種酶可使菌株C15所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)失活；發(fā)酵上清液經(jīng)堿性蛋白酶和胃蛋白酶處理后仍具有抑菌活性，抑菌圈直徑分別為1.26 mm、2.67 mm，但抑菌活性明顯下降（P＜0.05），即使上清液pH調(diào)回中性，其活力仍沒有恢復(fù)。因此，可初步判定該菌株所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)為一種蛋白類或多肽類物質(zhì)，這與唐春梅等[16，18]的研究結(jié)果相一致。此抑菌物質(zhì)可被人體內(nèi)的蛋白酶降解而不在體內(nèi)殘留，具有較高的安全性。

2.5 不同條件對抑菌物質(zhì)活性的影響

2.5.1 pH對抑菌物質(zhì)活性的影響

菌株C15發(fā)酵上清液經(jīng)不同pH處理后，其對李斯特菌抑菌效果見圖3。

圖3 pH值對菌株C15發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of antibacterial substances in the fermentation broth of strain C15

由圖3可知，當(dāng)pH為2.0～5.0時(shí)，抑菌活性普遍較強(qiáng)，抑菌圈直徑為19.9 mm～35.7 mm，與對照組18.25 mm（pH=2.0）、7.75mm（pH=3.0）相比有顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)pH為7.0～10.0時(shí)，上清液的抑菌圈直徑均＜9.3 mm；分析原因可能是在堿性條件下，pH值改變導(dǎo)致抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其活性降低。結(jié)果表明，菌株C15發(fā)酵上清液在酸性條件下活性較強(qiáng)，在中性及堿性條件下活性較弱，與大多數(shù)乳酸菌產(chǎn)的細(xì)菌素特性相似[19]。Lü X等[20]研究發(fā)現(xiàn)，分離自中國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中的乳酸菌所產(chǎn)的乳桿菌素MXJ32A能夠抑制多種食源性致病菌，且具有很好的pH值耐受性和熱穩(wěn)定性。

2.5.2 溫度對抑菌物質(zhì)活性的影響

菌株C15的發(fā)酵上清液經(jīng)不同溫度處理后對李斯特菌的抑菌效果見圖4。

圖4 溫度對菌株C15發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of antibacterial substances in the fermentation broth of strain C15

由圖4可知，隨著溫度的升高，菌株C15發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的抑菌活性逐漸下降，分析原因可能是高溫使蛋白質(zhì)或多肽失活，導(dǎo)致其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性下降。發(fā)酵上清液經(jīng)60℃處理20 min后，抑菌活性為對照組的61.96%；當(dāng)處理溫度為80℃時(shí)，抑菌圈直徑為5.10 mm，抑菌活性為對照組的54.35%；當(dāng)處理溫度為100℃和121℃時(shí)，無抑菌圈，說明高溫使菌株C15發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)失去抑菌活性。因此，菌株C15可適用于巴氏熱殺菌處理后的鮮奶和其他無需高溫處理的食品。

2.5.3 NaCl對抑菌物質(zhì)活性的影響

發(fā)酵上清液經(jīng)不同濃度的NaCl處理后對李斯特菌的抑菌效果見圖5。

圖5 1 mol/L NaCl體積分?jǐn)?shù)對菌株C15發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.5 Effect of NaCl(1 mol/L)concentration on the activity of antibacterial substances in the fermentation broth of strain C15

由圖5可知，隨著NaCl濃度的升高，菌株C15發(fā)酵上清液的抑菌活性逐漸減弱。當(dāng)1 mol/L NaCl體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，抑菌圈直徑對照組減少0.1 mm，說明菌株抑菌活性無顯著變化（P＞0.05）；當(dāng)1 mol/L NaCl體積分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，抑菌活性最低，抑菌圈直徑為7.30 mm；當(dāng)1 mol/L NaCl體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加至10%時(shí)，抑菌圈直徑為7.60 mm，分析原因可能是NaCl濃度過高，該環(huán)境自身對李斯特菌有抑制作用。結(jié)果表明，菌株C15發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)在NaCl濃度較高條件下仍具有抑菌活性。因此，該抑菌物質(zhì)具有良好的耐鹽性。

3 結(jié)論

本研究從湖南南山高山牧場的鮮牛奶中共分離出28株乳酸菌，其中7株對李斯特菌具有抑菌活性，且菌株C15的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌圈直徑為6.17mm。通過形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)，菌株C15被鑒定為乳酸乳球菌（Lactococcallactis），其所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)成分被初步判定為蛋白類或多肽類物質(zhì)，該抑菌物質(zhì)在酸性及中性條件下穩(wěn)定，有較好的熱穩(wěn)定性和耐鹽性，由于蛋白質(zhì)類物質(zhì)可被人體消化降解，不產(chǎn)生不良反應(yīng)，安全性高，在食品工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用前景。菌株C15所產(chǎn)具體抑菌物質(zhì)及其抑菌譜還有待進(jìn)一步研究，為開發(fā)天然、高效的生物防腐劑提供有價(jià)值的菌種資源。