不同菌株對(duì)酸奶品質(zhì)與感官特性的影響

劉文文，張靖晞，李 鍵，索化夷*

（1.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400715；3.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041）

隨著人民生活水平的提高，人們對(duì)身體健康和營(yíng)養(yǎng)的要求也越來(lái)越高。作為具有代表性的乳制品之一，酸奶種類(lèi)繁多[1]。酸奶的品質(zhì)受多方面因素影響（如原料、添加劑、發(fā)酵劑、發(fā)酵溫度及時(shí)間、貯藏條件等），其中酸奶發(fā)酵劑是酸奶產(chǎn)品產(chǎn)酸和產(chǎn)香的基礎(chǔ)和決定因素。復(fù)合酸奶發(fā)酵劑是由多種乳酸菌株共同組成的，這些菌株以不同比例共生在同一個(gè)微生態(tài)環(huán)境體系中，反復(fù)著互相促進(jìn)和拮抗的關(guān)系，形成了酸奶的微生物菌群[2]。微生物菌群不同，其產(chǎn)生的代謝活性物質(zhì)和抗菌物質(zhì)也不同，直接影響酸奶的質(zhì)地和風(fēng)味。劉慧等[3]用復(fù)合開(kāi)菲爾發(fā)酵劑制作的成品酸奶較市售酸奶凝乳時(shí)間短，組織凝固狀態(tài)結(jié)實(shí)，風(fēng)味較好且口感細(xì)膩，酸度適中，且有濃郁的酯香風(fēng)味。蘇敦等[4]用不同發(fā)酵特性的2株嗜熱鏈球菌、1株保加利亞乳桿菌和1株嗜酸乳桿菌，通過(guò)對(duì)單菌和復(fù)配菌發(fā)酵乳的感官分析，得到了6組優(yōu)化的含4株菌的發(fā)酵劑配方。

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是酸奶生產(chǎn)中最常用到的兩種乳酸菌菌種[5]。保加利亞乳桿菌具備良好的耐酸性和蛋白質(zhì)水解特性，可以發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸和一些羰基化合物，如通過(guò)丙酮酸代謝產(chǎn)生乙醛，乙醛是酸奶中最具有代表性的芳香物質(zhì)。保加利亞乳桿菌還可以水解蛋白質(zhì)為嗜熱鏈球菌提供肽類(lèi)以供其生長(zhǎng)[6]。隨著研究不斷深入，越來(lái)越多的酵母菌屬被從以牦牛酸奶為首的各種乳制品中分離檢測(cè)出來(lái)，如開(kāi)菲爾酸奶[7]、中國(guó)酸馬奶[8]、西藏曲拉[9]、川西北地區(qū)的牦牛酸奶[10]等。酵母菌可消耗對(duì)乳酸菌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用的副產(chǎn)物乳酸鹽，更利于乳酸菌生長(zhǎng)[11-13]。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的發(fā)酵過(guò)程對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌有協(xié)同和促進(jìn)成型的作用[14]。干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌是能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制的益生菌，因而備受關(guān)注，將這兩種菌應(yīng)用于酸奶發(fā)酵中，能調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡且促進(jìn)人體吸收。

因此，本研究將不同發(fā)酵特性的優(yōu)良菌株進(jìn)行組合對(duì)酸奶進(jìn)行發(fā)酵，以期提升發(fā)酵劑的整體性能，為新型酸奶的研究和生產(chǎn)提供理論參考并奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用菌株：從自然發(fā)酵牦牛酸乳中分離純化，本實(shí)驗(yàn)室保存；開(kāi)菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefiri）700、酵母菌（Saccharomyces）Y18、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）N14、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）L16、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）GL2、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）GL6。

1.1.2 原料和試劑

純牛奶：中國(guó)蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）、L-谷氨酸鈉、甲醇（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；CT3 25K質(zhì)構(gòu)儀：美國(guó)Brookfield博勒飛公司；SWCJ-2F潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；DGG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與凍干粉的制備

將冷凍保存的菌株以6%的接種量接種至液體培養(yǎng)基傳3代進(jìn)行活化，將第3代的菌培養(yǎng)液4000r/min離心10min，棄上清液后，加入0.9%無(wú)菌生理鹽水多次洗滌，棄上清液，按照菌懸液∶脫脂乳保護(hù)劑=10∶1（V/V）的比例向菌泥中加入適量經(jīng)滅菌處理的脫脂乳保護(hù)劑，置于-80℃溫度條件下預(yù)冷6h后，使用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥20h，得到各個(gè)菌株的凍干菌粉，熔封，置于-20℃溫度條件下保藏。

1.3.2 凍干菌粉的活菌計(jì)數(shù)

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[15]中菌落總數(shù)測(cè)定的方法加以調(diào)整后測(cè)定，對(duì)6種菌粉的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，單位為CFU/g。

1.3.3 酸奶的制備

制作流程：50 mL配料（純牛奶、8%白砂糖）經(jīng)殺菌后（95℃、15 min）冷卻至室溫后倒入相應(yīng)的菌粉，按照10%接種量進(jìn)行接種。發(fā)酵至凝乳后（發(fā)酵溫度37℃），放入4℃冰箱中進(jìn)行后熟。所接菌種組合分別編號(hào)為組1（N14∶L16=1∶1）、組2（N14∶L16∶GL2=1∶1∶1）、組3（N14∶L16∶GL6=1∶1∶1）、組4（N14∶L16∶700=1∶1∶1）、組5（N14∶L16∶Y18=1∶1∶1）；用5組發(fā)酵劑組合所發(fā)酵的酸奶編號(hào)分別為組1（LS）、組2（LSGL2）、組3（LSGL6）、組4（LS700）、組5（LSY18），以市售酸奶（TY）為對(duì)照。

1.3.4 酸度測(cè)定

依照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測(cè)定》[16]中酸度測(cè)定的方法，每組酸奶測(cè)定3次，計(jì)算平均值，結(jié)果保留一位小數(shù)。

1.3.5 質(zhì)構(gòu)分析

采用CT3 25K型質(zhì)構(gòu)儀對(duì)酸奶進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析（texture profileanalysis，TPA）。設(shè)定參數(shù)如下：探頭型號(hào)TA25/1000；平端直徑50 mm；測(cè)試前探頭下降速度10.0 mm/s；測(cè)試速度1.0 mm/s；測(cè)試后探頭回程速度1.0 mm/s；時(shí)間5.00 s；測(cè)試距離15.00 mm；觸發(fā)力5 g。

測(cè)定指標(biāo)：第一循環(huán)硬度、粘力、彈力、膠著力。每組酸奶均測(cè)定3個(gè)平行。

1.3.6 有機(jī)酸的測(cè)定

采用高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)酸奶中的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析。色譜條件：Agilent XDB-C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；檢測(cè)溫度：35℃；流動(dòng)相：0.01 mol/L磷酸二氫銨緩沖溶液（pH=2.8）和甲醇（95∶5，V/V）；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；最大柱壓：1 500 Pa；可見(jiàn)光-紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。

1.3.7 感官評(píng)價(jià)分析

建立感官評(píng)價(jià)小組：在感官分析實(shí)驗(yàn)室里，根據(jù)GB/T 16291.1—2012《感官分析選拔、培訓(xùn)與管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則》[17]中提到的方法開(kāi)展感官能力、感官靈敏度和描述能力的測(cè)試，篩選人員后進(jìn)行感官分析基礎(chǔ)知識(shí)、識(shí)別及標(biāo)度的使用等感官描述性分析專(zhuān)項(xiàng)培訓(xùn)。通過(guò)該培訓(xùn)具有合格資格的8名評(píng)價(jià)員組成酸奶的感官評(píng)價(jià)小組。

建立酸奶感官描述詞：參考KOPPEL K等[18-19]建立感官描述詞的方法，根據(jù)MARISSSA M D等[20-21]建立的酸奶感官描述詞和參照物，整理出候選的酸奶感官描述詞，并將其與參照物、樣品一起呈送給感官評(píng)價(jià)小組。參照GB/T 10221—2012《感官分析術(shù)語(yǔ)》[22]選取適當(dāng)?shù)膮⒄瘴?，再由評(píng)價(jià)小組討論達(dá)成一致的采用0～15（0.5增量）的標(biāo)度法來(lái)表示參照物強(qiáng)度。感官評(píng)價(jià)指標(biāo)相應(yīng)參比見(jiàn)表1。

表1 酸奶感官描述詞匯Table 1 Sensory description vocabulary of yoghurt

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel（2010）版軟件制作蘋(píng)果酸、乙酸、檸檬酸、乳酸各自的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線并得出相應(yīng)曲線方程、R2、RSD。應(yīng)用XLSTAT 2016軟件對(duì)酸奶的感官特征進(jìn)行主成分分析（principle component analysis，PCA）和聚類(lèi)分析（agglomerative hierarchical clustering，AHC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干菌粉活菌數(shù)

測(cè)得6株凍干菌粉的活菌數(shù)均在106CFU/g以上，符合GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》[23]對(duì)酸奶制作的要求。

2.2 酸度

各組酸奶凝乳時(shí)間及強(qiáng)度結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，添加干酪乳桿菌（GL2）和開(kāi)菲爾乳桿菌（700）菌株的酸奶凝乳時(shí)間最短，為10 h，基礎(chǔ)菌株發(fā)酵的酸奶凝乳時(shí)間最長(zhǎng)，為13 h，說(shuō)明添加這4種菌株均能提高其凝乳速度。五組的酸奶酸度符合GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》的要求，均在70°T以上。相較于組1，在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌雙菌發(fā)酵的基礎(chǔ)上添加酵母菌（Y18）、干酪乳桿菌（GL2）、副干酪乳桿菌（GL6）、開(kāi)菲爾乳桿菌（700）均會(huì)提高酸奶的酸度，其中分別添加GL2和700的酸奶的酸度明顯增加，這兩種菌與酸奶體系中的基礎(chǔ)菌種具有相互促進(jìn)作用，使得這兩種菌相較于GL6和Y18生長(zhǎng)的更好。添加酵母菌Y18的酸奶的酸度沒(méi)有明顯增加。

表2 各組酸奶凝乳時(shí)間及酸度Table 2 Curd time and acidity of each group of yoghurt

研究表明[24-25]，酸奶的最佳酸度范圍是80～120°T，乙醛、丁二酮等風(fēng)味物質(zhì)要經(jīng)過(guò)充分的后酸化過(guò)程才能達(dá)到發(fā)揮最佳效果的劑量，同時(shí)酸奶的組織狀態(tài)也會(huì)因此變得更加粘稠和堅(jiān)實(shí)。本試驗(yàn)中各組發(fā)酵乳凝乳時(shí)及后酸化的酸度均在80～120°T，說(shuō)明這五種菌株添加不會(huì)引起不愉悅的口感。

2.3 質(zhì)構(gòu)

對(duì)發(fā)生后酸化1 d的酸奶進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析，結(jié)果如表3所示。在基礎(chǔ)酸奶發(fā)酵劑的基礎(chǔ)上添加干酪乳桿菌（GL2）、副干酪乳桿菌（GL6）、開(kāi)菲爾乳桿菌（700）會(huì)顯著提高酸奶的第一循環(huán)硬度、彈性和膠著性（P＜0.05），其中組2樣品第一循環(huán)硬度、彈性和膠著性最大，其次是組4，最后是組3。組5與組1的質(zhì)構(gòu)特征最為接近。五組酸奶的粘力都保持在20～25 g之間，差距并不明顯，說(shuō)明這幾株菌的添加對(duì)酸奶的粘力影響是不大的。同時(shí)，酸化1d后酸奶的酸度與第一循環(huán)硬度、彈性、膠著性呈相同變化趨勢(shì)，說(shuō)明酸奶的酸度改變對(duì)酸奶的組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)和黏稠度等會(huì)產(chǎn)生影響。

表3 酸奶質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Table 3 Results of texture analysis of yoghurt

2.4 有機(jī)酸含量

采用高效液相色譜儀對(duì)酸奶中的乳酸、乙酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸這4種代表性有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量的測(cè)定，目的是對(duì)比五組酸奶中存在的有機(jī)酸成分差異。將五組酸奶樣品進(jìn)行HPLC分析，再將測(cè)得的五組酸奶中這4種有機(jī)酸的峰面積代入4種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中計(jì)算出各自的含量，結(jié)果如表4所示。

表4 五組酸奶中四種有機(jī)酸的含量Table 4 Contents of four organic acids in five groups of yogurt

乳酸是通過(guò)乳酸菌代謝生成的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，是發(fā)酵乳特有風(fēng)味的主要來(lái)源。由表4可知，除了Y18，其他3種菌株的添加均增加了酸奶的乳酸含量。檸檬酸是通過(guò)丙酮酸生物合成而來(lái)，可以代謝生成某些醇類(lèi)物質(zhì)，是發(fā)酵乳中特征風(fēng)味物質(zhì)的前提物質(zhì)。酵母菌Y18的添加明顯降低了發(fā)酵乳中檸檬酸含量，其他四組樣品檸檬酸含量差異不大。乙酸可以反應(yīng)成酯或氨基化合物，用作酸度調(diào)節(jié)劑、增味劑、香料等，為發(fā)酵乳提供揮發(fā)性風(fēng)味。乙酸在五組酸奶中的含量都很低，均＜2 mg/g。組5中，雖然乳酸和檸檬酸的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他組，但是其乙酸含量最高，達(dá)到1.44 mg/g，這可能與酵母菌在缺氧條件下額外生成的乙醇發(fā)生氧化有關(guān)。干酪乳桿菌GL2和開(kāi)菲爾乳桿菌700的添加降低了酸奶的蘋(píng)果酸含量，副干酪乳桿菌GL6添加升高了酸奶的蘋(píng)果酸含量。

2.5 感官評(píng)價(jià)

2.5.1 感官評(píng)分

由感官評(píng)價(jià)小組對(duì)5組酸奶樣品和1組市售酸奶進(jìn)行感官分析，最終的感官評(píng)分如表5所示。6組樣品感官評(píng)價(jià)總分為79.00分～92.55分，其中組2感官評(píng)價(jià)總分最高為92.55分，其次是組5和組4，感官評(píng)價(jià)總分分別為89.67分和89.56分，組1的感官評(píng)價(jià)總分為86.52分，組3和市售酸奶的感官評(píng)價(jià)總分最為接近，分別為79.17分和79.00分。

表5 六組酸奶的感官評(píng)分Table 5 Sensory scores of 6 groups of yogurt

續(xù)表

2.5.2 主成分分析

通過(guò)XLSTAT2016軟件對(duì)表5結(jié)果進(jìn)行分析。酸奶樣品和感官指標(biāo)在F1/F2坐標(biāo)中的分布情況如圖1所示。LS700作為唯一一組在第二象限的酸奶樣品，與其余5組酸奶樣品感官特性差距較大。LSGL2位于第四象限X軸最右面，在果香、蒸煮味、紙板味方面表現(xiàn)突出，雖然LSGL2與LSY18在紙板味、谷物味方面表現(xiàn)相似，但是LSY18具有更突出的甜味和黃油味。盡管LS、TY和LSGL6均在第三象限，但是在Y軸上的LSGL6與市售酸奶TY的感官屬性更為接近，尤其是在干燥感、奶味、澀味這三方面，LS則在口感質(zhì)地方面略微蝕牙。

圖1 酸奶樣品與感官指標(biāo)在F1/F2坐標(biāo)中的分布圖Fig.1 Distribution diagrams of yoghurt samples and sensory evaluation indexes in F1/F2

2.5.3 聚類(lèi)分析

對(duì)酸奶樣品的感官特征強(qiáng)度進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到的樹(shù)形圖如圖2所示。由圖2可知，6組酸奶樣品可分為三類(lèi)：第一類(lèi)是LS700，具有突出的發(fā)酵味，且細(xì)膩度和黏附性表現(xiàn)突出，這與該組酸奶的TPA檢測(cè)結(jié)果相符；第二類(lèi)有LSGL2和LSY18，它們?cè)诠丁⒐任镂?、紙板味、果香特征表現(xiàn)較顯著，在分散性方面較相似；由于LS、LSGL6、TY這三組酸奶樣品在蝕牙、干燥感、澀味、奶味方面表現(xiàn)較為突出且相似，故這三組被歸為成第三類(lèi)。

圖2 酸奶的凝聚層次聚類(lèi)樹(shù)形圖Fig.2 A gglomerative hierarchical clustering dendrogram of yoghurt

3 結(jié)論

復(fù)合發(fā)酵劑可直接影響酸奶的品質(zhì)特性。向基于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為主要乳酸菌的牛乳中分別添加干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、酵母菌、開(kāi)菲爾乳桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵，添加第3種菌種會(huì)增加酸奶體系的酸度，其中添加干酪乳桿菌（GL2）和開(kāi)菲爾乳桿菌（700）的酸奶酸度變化較大，說(shuō)明GL2和700在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的酸奶系統(tǒng)中長(zhǎng)勢(shì)較佳。酸度的大小影響著酸奶的稠實(shí)和彈性，以添加干酪乳桿菌（GL2）的酸奶在彈性（9.82mm）、膠著性（86 g）方面最為突出。5組樣品4種有機(jī)酸含量由高到低依次是：檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸、乙酸，添加GL2、700和GL6提高了酸奶中乳酸的含量。添加干酪乳桿菌（GL2）的酸奶感官評(píng)分最高，在果香、蒸煮味、紙板味方面表現(xiàn)突出，但添加副干酪乳桿菌（GL6）的酸奶的感官特征與市售酸奶最為接近。