不同來源酒曲釀制米酒中乳酸菌的分離與鑒定

向凡舒，鄧 風(fēng)，魏冰倩，鐘小丹，張振東，郭 壯，趙慧君*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北 孝感 432003）

米酒，又稱甜酒、酒釀、醪糟等，是一種澄清并具有甜味、略帶酸味的發(fā)酵類含酒精飲料，通常以糯米類作物為原料，以米酒曲為發(fā)酵劑室溫發(fā)酵2～3 d制得。米酒作為一種混合菌發(fā)酵產(chǎn)品，其質(zhì)量和風(fēng)味的好壞取決于米酒曲中微生物的群落組成及各菌種之間的代謝關(guān)系、代謝產(chǎn)物與產(chǎn)品的比例關(guān)系等。米酒曲是在特定的生態(tài)環(huán)境中，用成曲作為母種培養(yǎng)制作而成，含有包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的大量微生物，對米酒品質(zhì)的形成起著決定性作用，因而有“曲是酒之骨”之稱[1-3]。相對于工業(yè)化生產(chǎn)的米酒曲，民間傳統(tǒng)釀造米酒曲中微生物多樣性更高，釀造的米酒風(fēng)味也更為獨(dú)特，同時(shí)也加劇了不同地區(qū)間米酒風(fēng)味的差異。

目前，關(guān)于孝感米酒中微生物的研究多集中在霉菌和酵母菌，王小紅等[4-5]采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法對孝感米酒或米酒曲中根霉和酵母菌進(jìn)行了分離。目前，研究和應(yīng)用的乳酸菌多從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品、泡菜或者人體腸道中分離得到，而以米酒曲為分離源的乳酸菌報(bào)道尚少。乳酸菌在米酒發(fā)酵過程中起到了關(guān)鍵的作用，其產(chǎn)生的乳酸、乙醛和雙乙酰等風(fēng)味物質(zhì)對米酒的感官品質(zhì)具有顯著地影響。米酒中乳酸菌多樣性的研究已有很多，主要是基于宏基因組學(xué)方法和傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法。JIAO J K等[6-9]利用（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)分別對中國6個(gè)不同地區(qū)米酒、韓國燒酒發(fā)酵過程、韓國米酒以及中國7個(gè)不同地區(qū)米酒曲中乳酸菌的多樣性進(jìn)行了研究。除韓國燒酒在發(fā)酵過程中乳酸菌不是優(yōu)勢菌株外，其余均檢測到多種乳酸菌；沈馨等[10]采用MiSeq高通量測序分析孝感鳳窩酒曲細(xì)菌多樣性發(fā)現(xiàn)，12個(gè)核心優(yōu)勢操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）中，2個(gè)隸屬于乳酸菌；苗乘源等[11-14]采用純培養(yǎng)方法對傳統(tǒng)釀造米酒中的優(yōu)勢微生物及乳酸菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同來源米酒中的乳酸菌種類也不相同，具有地方差異性；沈馨等[15-16]從米酒中分離乳酸菌并研究其對米酒和黃酒品質(zhì)的影響，探索米酒中乳酸菌在工業(yè)應(yīng)用中的潛力。

本研究分別以湖北孝感和四川成都來源的米酒曲為發(fā)酵劑發(fā)酵制作米酒，并采用改良MRS培養(yǎng)基、分子生物學(xué)技術(shù)對米酒中的乳酸菌進(jìn)行了分離、鑒定，深入研究傳統(tǒng)制作米酒中乳酸菌的多樣性，對其微生物多樣性信息進(jìn)行全面系統(tǒng)的解析具有極為重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 米酒曲

酒曲：從湖北孝感地區(qū)和四川成都地區(qū)各采集10種，分別編號為XG1-XG10和CD1-CD10，其中孝感地區(qū)采集的米酒曲均為鳳窩酒曲，成都導(dǎo)區(qū)采集的米酒曲為農(nóng)家自制。

1.1.2 試劑

苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、Tris、乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸鈉、冰乙酸、碳酸鈣、氯化鈉、瓊脂粉等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；r Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）聚合酶（5U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、pMD18-T、DNAMarker：大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖（均為生化試劑）、溶菌酶（酶活≥20000U/mg）、蛋白酶K（40 U/mg）、2×PCR mix、大腸桿菌（Escherichia coli）Top 10感受態(tài)細(xì)胞、氨芐青霉素：索來寶生物技術(shù)有限公司；AXGEN PCR清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；引物：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS固（液）體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

改良MRS固體培養(yǎng)基[17]：在MRS固體培養(yǎng)基中添加1.5%的CaCO3。

LB液體培養(yǎng)基[18]：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。添加瓊脂粉15 g/L為LB固體培養(yǎng)基。

上述培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250厭氧工作站：英國Don Whitley Scientific公司；CT15RE冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PTC-100PCR儀：美國ABI公司；DYY-BC型電泳儀：北京六一儀器廠；Fluor Chem FC3：美國ProteinSimple公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米酒的制作工藝流程及操作要點(diǎn)

4.檢驗(yàn)方法。同一檢驗(yàn)項(xiàng)目中一般存在著不同種類的檢驗(yàn)方法，方法選取不當(dāng)也會造成食品檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，從而影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

按照參考文獻(xiàn)[19]制作米酒。操作要點(diǎn)：糯米浸泡、蒸煮和攤涼后，按照每千克糯米添加3 g米酒曲的比例進(jìn)行落罐搭窩，并在28℃發(fā)酵48 h備用。

1.3.2 乳酸菌的分離與純化

無菌條件下，取1mL米酒，加入9mL生理鹽水中，然后以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋后，吸取0.2mL稀釋度為10-5和10-6的稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度重復(fù)3次，置于30℃厭氧工作站中倒置培養(yǎng)48h。待乳酸菌長出后，在改良MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離純化2～3次，挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)24h。革蘭氏染色后進(jìn)行鏡檢，同時(shí)進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)。將純種、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株保存于-80℃超低溫冰箱中保藏。

1.3.3 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

參照文獻(xiàn)[20]提取乳酸菌的基因組DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）PCR擴(kuò)增乳酸菌的16SrDNA基因。PCR擴(kuò)增體系：10×r Taq buffer（Mg2+plus）2.5 μL，27F（10 mmol/L）0.5 μL，1495R（10 mmol/L）0.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2 μL，r Taq DNA polymerase（5U/μL）0.5μL，DNA模板2μL，無菌水補(bǔ)足25μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AXGEN PCR清潔試劑盒清潔后，與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆子進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證陽性克隆。引物為M13F（-47）（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）和M13R（-48）（5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′）。PCR擴(kuò)增體系：2×PCR mix 12.5 μL，M13F（-47）（10 mmol/L）0.5 μL，M13R（-48）（10 mmol/L）0.5 μL，菌液2 μL，無菌水補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增條件同16S rDNA擴(kuò)增條件。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，陽性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA 4.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21-22]，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的分離結(jié)果

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)進(jìn)行乳酸菌的分離，選取改良MRS固體培養(yǎng)基上有透明圈、過氧化氫酶陰性和革蘭氏陽性的菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。從10個(gè)孝感米酒曲制作的米酒中共分離到42株疑似乳酸菌，菌株編號為XG1-1～XG1-4、XG2-1～XG2-3、XG3-1～XG3-3、XG4-1～XG4-5、XG5-1～XG5-4、XG6-1～XG6-3、XG7-1～XG7-4、XG8-1～XG8-3、XG9-1～XG9-6、XG10-1～XG10-7。從10個(gè)成都米酒曲制作的米酒中共分離到的35株疑似乳酸菌，菌株編號為CD1-1～CD1-5、CD2-1～CD2-4、CD3-1～CD3-4、CD4-1～CD4-5、CD5-1～CD5-4、CD6-1～CD6-3、CD7-1～CD7-3、CD8-1～CD8-3、CD9-1～CD9-3、CD10-1。

2.2 孝感米酒曲制作的米酒中乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

42株乳酸菌的16S rDNA測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性比對，并申請了登錄號，結(jié)果見表1。

表1 孝感米酒中乳酸菌16S rDNA基因序列的比對結(jié)果及登錄號Table 1 Alignment results of 16S rDNA sequences and accession number of lactic acid bacteria from Xiaogan rice wine

基于16S rDNA基因序列，采用MEGA 4.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建孝感米酒中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria from Xiaogan rice wine based on 16S rDNA gene sequences

由圖1可知，菌株XG1-1、XG1-4、XG2-2、XG3-2、XG4-3、XG4-4、XG5-1、XG5-2、XG5-3、XG5-4、XG6-1、XG6-3、XG7-1、XG7-2、XG7-3、XG7-4、XG8-1、XG8-2、XG9-1、XG10-5與P.pentosaceus聚于一支，相似度較高；菌株XG1-2、XG2-1、XG4-2、XG4-5、XG9-3、XG9-5、XG9-6、XG10-1、XG10-3、XG10-4與W.confusa聚于一支，相似度較高；菌株XG1-3、XG2-3、XG3-1、XG6-2、XG9-2、XG10-6與L.plantarum聚于一支，相似度較高；菌株XG8-3、XG9-4、XG10-2與E.faecium聚于一支，相似度較高；菌株XG3-3與L.fermentum聚于一支，相似度較高；菌株XG4-1與L.agilis聚于一支，相似度較高；菌株XG10-7與L.lactis聚于一支，相似度較高；因此，42株乳酸菌分別被鑒定為P.pentosaceus（20株）、W.confusa（10株）、L.plantarum（6株）、E.faecium（3株）、L.fermentum（1株）、L.agilis（1株）、L.lactis（1株）。

2.3 成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

35株乳酸菌的16S rDNA測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性比對，并申請了登錄號，結(jié)果見表2。

基于16S rDNA基因序列，采用MEGA 4.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

表2 成都米酒中乳酸菌16S rDNA基因序列的比對結(jié)果及登錄號Table 2 Alignment results of 16S rDNA sequences and accession number of lactic acid bacteria from Chengdu rice wine

續(xù)表

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建成都米酒中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria from Chengdu rice wine based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株CD1-1～CD1-5、CD2-1、CD2-2、CD3-4、CD4-1～CD4-3、CD5-1、CD5-2、CD6-2、CD6-3、CD7-1、CD8-2、CD8-3、CD9-1、CD10-1與P.pentosaceus聚于一支，相似度較高；菌株CD3-1、CD3-3、CD4-5、CD7-2、CD9-2與L.plantarum聚于一支，相似度較高；菌株CD3-2、CD5-3、CD5-4、CD8-1與W.cibaria聚于一支，相似度較高；菌株CD2-3、CD6-1與W.confusa聚于一支，相似度較高；菌株CD4-4、CD9-3與L.brevis聚于一支，相似度較高；菌株CD2-4與E.faecium聚于一支，相似度較高；菌株CD7-3與L.johnsonii聚于一支，相似度較高；因此，42株乳酸菌分別被鑒定為P.pentosaceus（20株）、L.plantarum（5株）、W.cibaria（4株）、W.confusa（2株）、L.brevis（2株）、E.faecium（1株）、L.johnsonii（1株）。

2.4 孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的比較

孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的比較結(jié)果見表3。

表3 孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的比較Table 3 Comparison of lactic acid bacteria between Xiaogan rice wine and Chengdu rice wine

由表3可知，在兩種米酒中，分離的P.pentosaceus數(shù)量均最多，均為20株，分別占總分離乳酸菌數(shù)的47.6%、57.1%，說明P.pentosaceus為兩種米酒的優(yōu)勢菌株。除P.pentosaceus外，兩種米酒中分離出的相同種屬的菌株還包括W.confusa、L.plantarum和E.faecium，其中，W.confusa在孝感米酒中分離出10株，在成都米酒中僅分離出2株；L.plantarum在孝感和成都米酒中分別分離出6株和5株，E.faecium在兩種米酒中分離出的數(shù)量均較少。L.fermentum、L.agilis和L.lactis為孝感米酒中特有的乳酸菌，但數(shù)量均較少，均只分離到1株。W.cibaria、L.johnsonii和L.brevis為成都米酒中特有的乳酸菌，其中W.cibaria有4株，而L.johnsonii和L.brevis數(shù)量較少，分別分離到1、2株。結(jié)果表明，孝感米酒曲和成都米酒曲中的優(yōu)勢乳酸菌相同。

JIAO J K等[6]利用PCR-DGGE方法研究黑龍江、南京6個(gè)不同樣本中的乳酸菌發(fā)現(xiàn)，L.plantarum、L.namurensis和P.acidilactici為優(yōu)勢菌株，與本研究分離的優(yōu)勢乳酸菌株為P.pentosaceus具有差異。張振東等[9，15-16，22]均采用純培養(yǎng)方法從孝感米酒中分離乳酸菌，與本研究相比，雖然優(yōu)勢乳酸菌均有所不同，但是菌株的種屬上是一致的，且本研究中分離得到的乳酸菌種類最全。

JIAO J K等[6]將分離到的乳酸菌用于米酒的發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，參與發(fā)酵的乳酸菌的種類越多，米酒的感官特性就越好。王丹丹等[22]將分離自孝感米酒的乳酸菌用于米酒的制作發(fā)現(xiàn)，分離到的乳酸菌對米酒有機(jī)酸種類與含量、固形物含量與米酒的滋味產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05），且同一類乳酸菌對米酒滋味具有類似的影響?？梢娙樗峋诿拙瓢l(fā)酵過程中起到了關(guān)鍵的作用，其對米酒的感官品質(zhì)具有顯著地影響。本研究中分離到的各類菌株對米酒滋味的影響是下一步研究的重點(diǎn)。

3 結(jié)論

采用孝感鳳窩米酒曲和成都農(nóng)家自制米酒曲制作米酒，利用含有1.5%CaCO3的改良MRS培養(yǎng)基從兩種米酒中共分離得到77株乳酸菌，其中，從孝感米酒中分離出42株乳酸菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，隸屬于7個(gè)種，分別為P.pentosaceus（20株）、W.confusa（10株）、L.plantarum（6株）、E.faecium（3株）、L.fermentum（1株）、L.agilis（1株）、L.lactis（1株）。從成都米酒中共分離出35株乳酸菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，隸屬于7個(gè)種，分別為P.pentosaceu s（20株）、L.plantarum（5株）、W.cibaria（4株）、W.confusa（2株）、L.brevis（2株）、E.faecium（1株）、L.johnsonii（1株）。兩種米酒中分離的P.pentosaceus數(shù)量最多，分別占47.6%、57.1%，為優(yōu)勢菌株。除P.pentosaceus外，兩種米酒中分離出的相同種還包括W.confusa、L.plantarum和E.faecium；L.fermentum、L.agilis和L.lactis為孝感米酒中特有的乳酸菌，W.cibaria、L.johnsonii和L.brevis為成都米酒中特有的乳酸菌。