高產(chǎn)酯化酶紅曲菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

劉歡歡，楊 帆，李貞景，王旭鋒，薛意斌，陳勉華，王昌祿*

（1.天津科技大學(xué) 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

紅曲菌屬（Monascus spp.）是我國重要的藥食兩用微生物，能夠產(chǎn)生多種酶系，包括酯化酶、糖化酶及酸性蛋白酶等，在發(fā)酵食品中具有非常重要的意義[1-2]。其中，酯化酶可催化多種有機(jī)酸與乙醇生成己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯類物質(zhì)，使?jié)庀阈桶拙频南銡飧迂S滿協(xié)調(diào)[3-4]。

至今為止，關(guān)于紅曲霉產(chǎn)酯化酶的研究主要包括：高產(chǎn)酯化酶紅曲菌株的分離、純化、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[1，5-7]；多酶系紅曲菌株的研究[8]；紅曲霉發(fā)酵黃水研究[9]；紅曲霉酯化黃水制備酯化液[10]；復(fù)合酯化酶制劑的研究[11]等。有研究表明，酵母、紅曲霉共發(fā)酵與堆積發(fā)酵配套工藝相結(jié)合，能使白酒中總酯含量增加，尤其是己酸乙酯，提高白酒酯化液品質(zhì)[9，12]。目前，在工業(yè)上，一般采用固態(tài)發(fā)酵紅曲霉產(chǎn)酯化酶[5-7]。然而，固態(tài)發(fā)酵受傳質(zhì)傳熱以及發(fā)酵調(diào)控的限制[13]，導(dǎo)致紅曲發(fā)酵周期長，酶制備效率低。因此，通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性酯化酶，具有較大的潛力。

本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏的10株紅曲菌株中篩選1株高產(chǎn)酯化酶的菌株，通過分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，并對其最適培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，最后對該紅曲霉所產(chǎn)的酯化酶酶學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為利用紅曲菌對白酒增香提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紅曲菌株M1、M3、M7、M8、M9、M11、X1、X2、CG-6、C003：天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室保藏。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司；蛋白胨（生化試劑）、2×Primer STAR Buffer、Taq聚合酶（5 U/μL）：北京索萊寶生物有限公司；硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖等（均為分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行制備。

種子液培養(yǎng)基：大米粉30 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH自然。

初篩培養(yǎng)基：無水葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO310 g/L，KH2PO410 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，pH自然。

復(fù)篩培養(yǎng)基1：可溶性淀粉70 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，NaNO32g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O2g/L，pH 4.5；復(fù)篩培養(yǎng)基2：葡萄糖50g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO32g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH 5.0；復(fù)篩培養(yǎng)基3：大米粉50 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH自然；復(fù)篩培養(yǎng)基4：在復(fù)篩培養(yǎng)基3的基礎(chǔ)上加入20 g/L大豆蛋白胨。

以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺：上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；KCL2000型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：日本EYELA東京理化公司；AG22331型高速離心機(jī)：德國Ep pendorf公司；070-851型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；ZWY-2112D型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海支撐分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)酯化酶紅曲菌株的篩選

將紅曲菌株M1、M3、M7、M8、M9、M11、X1、X2、CG-6、C003的孢子懸浮液（5.0×105個(gè)/mL）以10%（V/V）的接種量接種到初篩培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 d，以發(fā)酵上清液中的酯化酶活力為指標(biāo)進(jìn)行初篩。

以10%的接種量將初篩菌株的孢子懸浮液分別接種于復(fù)篩培養(yǎng)基1、2、3，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d，定期檢測上清液中酯化酶酶活變化，以達(dá)到最高酯化酶活力時(shí)間、酶活力為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.2 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶培養(yǎng)基的選擇

將菌株X1、X2接種于4種復(fù)篩培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到最高酶活為止，以酯化酶活力為指標(biāo)，選擇紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的最佳培養(yǎng)基。

1.3.3 酯化酶活性的測定

采用1-萘酚比色法對酯化酶酶活進(jìn)行測定[15]。將0.5mL上清液和3 mL pH=6.0的磷酸緩沖液混合后，添加0.1 mL 1-醋酸萘酯，空白組不添加1-醋酸萘酯，37℃水浴反應(yīng)15min后加0.4 mL固藍(lán)B鹽，37℃保溫10 min，在波長528 nm處測定吸光度值。

酯化酶酶活定義：在pH=6.0、37℃條件下，15 min水解1-醋酸萘酯產(chǎn)生1.0 nmol的1-萘酚所需酶量為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

1.3.4 紅曲霉菌種的分子生物學(xué)鑒定

將菌株X1的孢子懸浮液接種于復(fù)篩培養(yǎng)基2中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3d，8000r/min離心10min，取菌體，無菌水反復(fù)沖洗3次后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用DNA試劑盒法提取菌株X1的DNA，以其為模板，采用通用引物ITS-1（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3"）和ITS-4引物（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]。

PCR擴(kuò)増?bào)w系：DNA模板2 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5 mmol/L）4 μL，2×Primer STAR Buffer 25 μL，引物各1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：96℃預(yù)變性1 min；96℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像儀中觀察條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索，選取同源性較高的菌株，采用軟件clustal×1.83進(jìn)行多序列比對，用MEGA 5.10軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.3.5 酯化酶酶學(xué)特性研究

最適反應(yīng)溫度及pH值：設(shè)定反應(yīng)溫度分別為25℃、35℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、55 ℃；pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。測定酯化酶活力，研究酯化酶的最適反應(yīng)溫度及pH值。

溫度及pH穩(wěn)定性：將粗酶液在25℃、35℃、45℃、55℃、65 ℃條件下分別水浴0、10 min、20 min、30 min、40 min后，冷卻；將pH 5.0、6.0、7.0、8.0的3 mL磷酸鹽緩沖溶液分別與0.5 mL酶液混合均勻，在4℃條件下保存24 h。測定殘余酶活力，最大酶活力記為100%，計(jì)算相對酶活力，研究該酯化酶的溫度及pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酯化酶紅曲菌株的篩選

采用初篩培養(yǎng)基對10株紅曲霉進(jìn)行初篩，酯化酶活力測定結(jié)果見圖1。

圖1 不同紅曲霉的酯化酶活力Fig.1 Esterase activity of different Monascus

由圖1可知，不同紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的能力不同，其中菌株X2的酯化酶活力最高，為346.28 U/mL，菌株X1次之（338.37 U/mL），菌株M1、M3、M7、M8、C003等產(chǎn)酯化酶能力較低。菌株X1和X2的酯化酶活力差異較小，因此，采用3種復(fù)篩培養(yǎng)基（1、2、3）對菌株X1和X2進(jìn)行進(jìn)一步篩選，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株X1（a）和X2（b）在不同培養(yǎng)基中的酶活Fig.2 Enzyme activity of strain X1(a)and X2(b)in different media

由圖2可知，無論何種培養(yǎng)基，兩株菌的發(fā)酵上清液中酯化酶酶活均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，菌株X1和X2在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，最高酶活出現(xiàn)時(shí)間均相同，可見兩株菌的生長和酯化酶生產(chǎn)狀況非常相近。從最高酶活出現(xiàn)的時(shí)間上看，復(fù)篩培養(yǎng)基2最早，這可能與培養(yǎng)基中碳源有關(guān)[18]。此外，復(fù)篩培養(yǎng)基3中沒有加入遲效氮源，影響了酯化酶的產(chǎn)生[19]。為此，在復(fù)篩培養(yǎng)基3中加入20 g/L的大豆蛋白胨，成為復(fù)篩培養(yǎng)基4，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶培養(yǎng)基的選擇

采用4種復(fù)篩培養(yǎng)基對菌株X1和X2進(jìn)行發(fā)酵，重復(fù)3次，從中選擇穩(wěn)定性最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株X1和X2在不同復(fù)篩培養(yǎng)基中的酯化酶活性Fig.3 Esterase activity of strain X1 and X2 in different secondary screening media

由圖3可知，菌株X1和X2在復(fù)篩培養(yǎng)基1的酯化酶活力高于其他3種培養(yǎng)基，且穩(wěn)定性良好，由此可知，復(fù)篩培養(yǎng)基1更適合紅曲霉菌株的生長及產(chǎn)酶；菌株X1的酯化酶活力均高于菌株X2，且在復(fù)篩培養(yǎng)基1條件下，酯化酶酶活最高，為315.19 U/mL，菌株X2為X1酶活的92.07%。因此，菌株X1在液態(tài)條件下發(fā)酵分泌酯化酶能力更強(qiáng)。同時(shí)，培養(yǎng)基4中，大豆蛋白胨的加入有效提高了發(fā)酵液的酶活力，但仍顯著低于復(fù)篩培養(yǎng)基1和2。因此，選擇菌株X1進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株X1的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 基于ITS序列菌株X1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain X1 based on ITS sequences

由圖4可知，菌株X1與血紅紅曲霉（Monascussanguineus）聚于一支，相似度最高。因此，鑒定菌株X1為血紅紅曲霉（Monascus sanguineous）。

2.4 酯化酶酶學(xué)特性分析結(jié)果

2.4.1 酯化酶的最適反應(yīng)溫度及pH值

酯化酶的最適反應(yīng)溫度及pH值測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 酯化酶的最適溫度及pHFig.5 Optimal temperature and pH of esterase

由圖5可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，酯化酶活力呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，酯化酶活力最高，為557.9 U/mL。分析原因可能是，酶作為反應(yīng)催化劑，溫度可影響其本身某些基團(tuán)的解離、與底物的結(jié)合等[20]。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速率加快，酶促反應(yīng)速率加快，而溫度過高，蛋白開始變性，酶活降低。因此，該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。

由圖5可知，隨著反應(yīng)體系pH值的增大，酯化酶活力呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)反應(yīng)pH值為5.0時(shí)，酯化酶活力最高，為497.8U/mL。分析原因可能是，酶分子上有酸性和堿性的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，可直接影響底物的結(jié)合和進(jìn)一步催化反應(yīng)，也可能影響酶的空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶的活性[21]；此外，酶活性部位的解離以及底物結(jié)構(gòu)的破壞都會導(dǎo)致酶-底物復(fù)合物不能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。因此，該酶的最適反應(yīng)pH值為5.0。

2.4.2 酯化酶的溫度及pH穩(wěn)定性

酯化酶的溫度及pH穩(wěn)定性結(jié)果見圖6。

圖6 酯化酶的溫度和pH穩(wěn)定性Fig.6 Temperature and pH stability of esterase

由圖6可知，當(dāng)酯化酶在25℃和35℃條件下處理40 min后，相對酶活為78.08%、71.50%，酯化酶穩(wěn)定性較好；45℃條件下處理40 min后，相對酶活為50.01%，酶穩(wěn)定性較差；當(dāng)處理溫度為55℃和65℃時(shí)處理10 min后，相對酶活為26.05%和14.75%，40 min后酶活幾乎下降為0，酶活不穩(wěn)定。因此，該酯化酶在25～35℃條件下穩(wěn)定性較好。

當(dāng)pH值在5.0～6.0時(shí)，處理24 h后，酯化酶相對酶活＞80%，酯化酶較穩(wěn)定，尤其是在pH 6.0緩沖液中保存時(shí)，相對酶活為90.65%；當(dāng)pH值＞6.0時(shí)，酯化酶酶不穩(wěn)定；pH為8.0時(shí)，相對酶活迅速降低為32.5%，表明該酶在堿性條件下易失活。

2.4.3 金屬離子對酯化酶活力的影響

不同金屬離子對酯化酶酶活的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同金屬離子對酯化酶活性的影響Fig.7 Effect of different metal ions on esterase activity

由圖7可知，Ca2+可以明顯促進(jìn)該紅曲酯化酶的活性，相對酶活為110.28%，因此，可作為該酶的促進(jìn)劑；K+對酯化酶活力的影響不顯著；而Mg2+、Na+、Fe2+和Ag+對該酯化酶均具有不同程度的抑制作用，其中Ag+對該酯化酶的抑制作用最明顯，相對酶活僅為10.22%，是該酶的酶活抑制劑。

3 結(jié)論

本研究通過篩選得到一株高產(chǎn)酯化酶的紅曲霉菌株X1，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineous），其最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為可溶性淀粉70g/L，大豆蛋白胨20g/L，NaNO32 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，初始pH值4.5；采用最優(yōu)培養(yǎng)基，在30℃、180 r/min條件下發(fā)酵4 d后，酯化酶酶活力為315.19 U/mL。粗酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該酯化酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，在25～35℃穩(wěn)定性較好；最適pH值為5.0，在pH為5.0～6.0時(shí)，穩(wěn)定性較高；Ca2+可提高該酯化酶活性，Mg2+、Fe2+、Na+、Ag+則有不同程度抑制作用，且Ag+抑制作用最明顯，相對酶活僅為10.22%。本研究為紅曲霉液態(tài)條件下分泌酯化酶進(jìn)而制備酯化液提供參考，也為紅曲酯化酶制劑在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了更多依據(jù)。