海洋源低溫微生物產(chǎn)蘋果酸脫氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化

遲乃玉，肖景惠，倪瑞琪，于 爽，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）EC 1.1.1.37普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中，可以催化草酰乙酸（oxaloacetic acid，OAA）可逆地還原為蘋果酸[1]。MDH參與檸檬酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、蛋白質(zhì)合成、糖異生等代謝活動(dòng)[2]。在生物科學(xué)進(jìn)化分析領(lǐng)域，MDH廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性、個(gè)體發(fā)育和種間雜種分析的研究過程[3]。在農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，MDH被用作植物抗病性和易感性的早期鑒定和診斷標(biāo)記[4]。在食品工業(yè)領(lǐng)域，MDH被作為指示酶用以檢測(cè)L-蘋果酸[5]、醋酸[6]、檸檬酸[7]在食品中的含量。在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，MDH臨床診斷試劑盒應(yīng)用于急性肝損傷、肝癌、肺癌等疾病的早期診斷[8]。鑒于MDH具有以上重要的應(yīng)用價(jià)值，其制備工藝一直備受國內(nèi)外研究人員的關(guān)注?，F(xiàn)階段MDH的來源主要有兩個(gè)方面：一方面是從動(dòng)物肝臟、心肌組織中直接分離提??；另一方面是從微生物的發(fā)酵產(chǎn)物中提取。

目前，產(chǎn)MDH菌株多來源于陸生環(huán)境[9-11]，海洋作為一個(gè)獨(dú)特的生物環(huán)境，從其中篩選得到的MDH具有耐高鹽、適合低溫條件下應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)。本課題組從大連地區(qū)渤海海泥中分離得到一株高產(chǎn)MDH的墓畫大洋芽孢桿菌（Oceanobacillus picturae）XJH-11，為了進(jìn)一步考察該菌株的潛在應(yīng)用價(jià)值，提高其產(chǎn)MDH的能力，本研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化菌株XJH-11產(chǎn)MDH的發(fā)酵條件，討論了各因素對(duì)其產(chǎn)MDH能力的影響，從而為深入研究該菌株及后續(xù)的中試放大試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

墓畫大洋芽孢桿菌（Oceanobacillus picturae）XJH-11（Genbank NO.：MK050016）：分離于大連渤海海泥，遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心保藏。

牛肉膏、蛋白胨、Trition X-100、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、酵母膏、葡萄糖、硫酸鎂、瓊脂粉（均為生化試劑或分析純）：生物工程上海股份有限公司。

裂解溶液（0.1 mol/L，pH8 Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、1%Trition X-100、30 μmol/L DTT）：本實(shí)驗(yàn)室配制。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，海水配制，pH7.4，0.1 MPa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，硫酸鎂0.08g/L，海水配制，pH8.0，0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CRY-2112立式恒溫?fù)u床：上海茸研儀器有限公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SCIENTZ-650E超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；CR21N高速冷凍離心機(jī)：株式會(huì)社日立制作所；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液、粗酶液制備

將斜面保藏菌株墓畫大洋芽孢桿菌（Oceanobacillus picturae）XJH-11接種到裝液量為125 mL/500 mL的種子培養(yǎng)基中，并在25℃、150r/min搖床中振蕩培養(yǎng)36h，作為種子液。再將其以5%接種量接種到裝液量為125 mL/500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同的條件培養(yǎng)36 h。

取發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，取濕菌體經(jīng)0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH8.0）洗滌3次以上，直至菌體洗凈為止。將洗凈后的菌體重懸于裂解溶液中，冰浴條件下超聲波破碎，能量30%，每次破碎8 s，間隙9 s，破碎40 min。將破碎的菌液4℃、12 000 r/min離心20 min，上清液為粗酶液。

1.3.2 菌株產(chǎn)蘋果酸脫氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)[13-15]

（1）發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

碳源種類優(yōu)化：將可溶性淀粉、麩皮、秸稈粉、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、微晶纖維素作為單一碳源加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量為5 g/L，考察碳源種類對(duì)MDH酶活的影響；碳源含量優(yōu)化：確定最佳碳源種類后，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基碳源含量分別為2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L，考察碳源含量對(duì)MDH酶活的影響。

氮源種類優(yōu)化：確定最優(yōu)碳源的條件下，將蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氫銨、氯化銨、酵母膏、牛肉膏＋蛋白胨、尿素、磷酸氫二銨作為單一氮源加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量為10 g/L，考察氮源種類對(duì)MDH酶活的影響。氮源含量優(yōu)化：確定最佳氮源種類后，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基氮源含量分別為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，考察氮源含量對(duì)MDH酶活的影響。

無機(jī)鹽種類優(yōu)化：在確定最優(yōu)碳源、氮源的條件下，將CuSO4、KCl、MgSO4、NaCl、ZnCl2作為單一無機(jī)鹽離子加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加量為0.8 g/L，考察無機(jī)鹽種類對(duì)MDH酶活的影響。無機(jī)鹽含量優(yōu)化：確定最佳無機(jī)鹽種類后，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽含量分別為0.06 g/L、0.08 g/L、0.10 g/L、0.12 g/L、0.14 g/L，考察無機(jī)鹽含量對(duì)MDH酶活的影響。

發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化：分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.5、7、7.5、8、8.5、9，考察發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)酶活的影響。

（2）培養(yǎng)條件優(yōu)化

在確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，固定其他條件不變，分別調(diào)整發(fā)酵溫度為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40 ℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min、180 r/min、200 r/min，裝液量為50 mL/500 mL、75 mL/500 mL、100 mL/500 mL、125 mL/500 mL、150 mL/500 mL、175 mL/500 mL、200 mL/500 mL，接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；培養(yǎng)36 h后測(cè)定MDH酶活。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取8個(gè)影響因子作為研究對(duì)象，以MDH酶活（Y）為響應(yīng)值，Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)的試驗(yàn)次數(shù)N=12，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman測(cè)試結(jié)果中每個(gè)顯著影響因素效應(yīng)的大小，設(shè)定步長和變化方向，找出峰值，并快速逼近最佳值區(qū)域。

1.3.5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最佳爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，將具有最高酶活的一組用作中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面分析法用于優(yōu)化產(chǎn)酶條件參數(shù)的分析。運(yùn)用Design-Expert8.0.6軟件分析得到最優(yōu)結(jié)果，最后對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證。每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.3.6 測(cè)定方法

按照參考文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定MDH酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)蘋果酸脫氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)基碳源種類的優(yōu)化

圖1 不同碳源種類對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on malic dehydrogenase activity

由圖1可知，當(dāng)葡萄糖為單一碳源時(shí)，菌株XJH-11產(chǎn)生的MDH酶活最高，為22.07 U/mL。乳糖、可溶性淀粉和麩皮次之，微晶纖維素、秸稈粉、麥芽糖作為碳源時(shí)，酶活很低。因此，葡萄糖是菌株XJH-11產(chǎn)MDH的最適碳源。

2.1.2 葡萄糖添加量的優(yōu)化

圖2 葡萄糖添加量對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.2 Effect of glucose addition on malic dehydrogenase activity

由圖2可知，葡萄糖添加量從2.5g/L升至10g/L時(shí)，MDH酶活隨葡萄糖添加量的增加而增加，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到10 g/L時(shí)，MDH的酶活最高，為24.46U/mL。當(dāng)葡萄糖添加量＞10g/L之后，酶活降低，說明葡萄糖濃度的增加抑制了菌株XJH-11對(duì)葡萄糖的利用。因此，最適葡萄糖添加量為10g/L。

2.1.3 培養(yǎng)基氮源種類的優(yōu)化

由圖3可知，當(dāng)無機(jī)氮源用作唯一的氮源時(shí)，菌株XJH-11產(chǎn)MDH的酶活較低。當(dāng)利用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨以及牛肉膏＋蛋白胨時(shí)，酶活很高。因此，菌株XJH-11產(chǎn)MDH優(yōu)先利用有機(jī)氮源。其中酵母膏作為氮源時(shí)酶活最高，為24.52U/mL。因此，酵母膏是菌株XJH-11產(chǎn)MDH的最適氮源。

圖3 不同氮源種類對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on malic dehydrogenase activity

2.1.4 酵母膏添加量的優(yōu)化

圖4 酵母膏添加量對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.4 Effect of yeast extract addition on malic dehydrogenase activity

由圖4可知，酵母膏添加量為5～20 g/L時(shí)，酶活也隨之增加。當(dāng)酵母膏添加量達(dá)到25 g/L時(shí)，酶活下降。這表明過量濃度的酵母膏對(duì)菌體的生長有一定抑制作用，進(jìn)而影響MDH的合成。當(dāng)酵母膏添加量達(dá)到20 g/L時(shí)，酶活最高，為25.61 U/mL。因此，最適酵母膏添加量為20 g/L。

2.1.5 培養(yǎng)基無機(jī)鹽種類的優(yōu)化

圖5 不同無機(jī)鹽種類對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.5 Effect of different inorganic salts on malic dehydrogenase activity

由圖5可知，以硫酸鎂作為無機(jī)鹽時(shí)，菌株XJH-11產(chǎn)MDH酶活最高，為25.64 U/mL。原因可能是鎂離子參與穩(wěn)定酶的構(gòu)象，使其更易與底物接觸[16]。而氯化鉀和氯化鈉次之；原因可能是其有利于維持菌體細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓，能夠使菌體XJH-11更好的生長[17]。因此，硫酸鎂是菌株XJH-11產(chǎn)MDH的最適無機(jī)鹽。

2.1.6 硫酸鎂添加量的優(yōu)化

圖6 硫酸鎂添加量對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.6 Effect of magnesium sulfate addition on malic dehydrogenase activity

由圖6可知，當(dāng)硫酸鎂添加量為0.1 g/L時(shí)，MDH酶活最高，為26.13U/mL；硫酸鎂添加量為0.06g/L和0.14 g/L時(shí)，酶活分別為11.39 U/mL和12.59 U/mL；這表明硫酸鎂濃度過低或過高都會(huì)對(duì)菌體生長產(chǎn)生一定的抑制作用，從而影響酶的合成。因此，最適硫酸鎂添加量為0.1 g/L。

2.1.7 培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化

圖7 初始pH值對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.7 Effect of initial pH value on malic dehydrogenase activity

由圖7可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.5～8.0時(shí)，菌株XJH-11產(chǎn)MDH酶活也隨之增高；當(dāng)初始pH值為8.0時(shí)，酶活最高，為26.47U/mL；當(dāng)初始pH為8.5～9.0時(shí)，酶活雖有所下降，但仍具有較高的酶活，說明菌株XJH-11在堿性條件下，適合其產(chǎn)MDH。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH值為8.0。

2.1.8 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為10～25℃時(shí)，MDH酶活逐漸上升；發(fā)酵溫度為25℃時(shí)，MDH酶活最高，為26.87 U/mL；發(fā)酵溫度為30～40℃時(shí)，酶活隨之降低。因此，最適發(fā)酵溫度為25℃。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on malic dehydrogenase activity

2.1.9 轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

圖9 轉(zhuǎn)速對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.9 Effect of shaking speed on malic dehydrogenase activity

由圖9可知，MDH酶活隨轉(zhuǎn)速在140～150r/min范圍內(nèi)的增加而增高；當(dāng)轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)，酶活最高，為27.06 U/mL；轉(zhuǎn)速＞150 r/min之后，酶活隨之降低，可能是過高的轉(zhuǎn)速影響菌體的生長。因此，最適轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.1.10 裝液量的優(yōu)化

圖10 裝液量對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.10 Effect of liquid loading volume on malic dehydrogenase activity

由圖10可知，當(dāng)裝液量為（50～125）mL/500 mL時(shí)，菌株XJH-11產(chǎn)生的MDH酶活呈增加趨勢(shì)；當(dāng)裝液量為125 mL/500 mL時(shí)，酶活最大，為27.54 U/mL；當(dāng)裝液量為（150～200）mL/500mL時(shí)，酶活隨之下降。裝液量主要影響菌株對(duì)溶氧量的需求[18]。當(dāng)裝液量為125 mL/500 mL時(shí)，實(shí)現(xiàn)了菌株XJH-11溶氧量的最佳值，促進(jìn)了菌株的生長，并進(jìn)一步提高了菌株產(chǎn)酶量。因此，最適裝液量為125mL/500mL。

2.1.11 接種量的優(yōu)化

圖11 接種量對(duì)蘋果酸脫氫酶活力的影響Fig.11 Effect of inoculum on malic dehydrogenase activity

由圖11可知，當(dāng)接種量為2%～5%時(shí)，菌株MDH隨著接種量的增加而增加；當(dāng)接種量為5%時(shí)，酶活達(dá)到最大值，為27.08U/mL；當(dāng)接種量＞5%之后，酶活反而下降。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)是有限的，培養(yǎng)基中菌體數(shù)目過多也會(huì)影響菌株的生長，進(jìn)而影響菌株產(chǎn)酶。因此，最適接種量為5%。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選顯著因子[19-21]

基于單因素試驗(yàn)，Plackett-Burman（N=12）試驗(yàn)考察影響MDH發(fā)酵工藝中8個(gè)因素的顯著性。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果如表2所示，主效應(yīng)分析采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行，結(jié)果如表3所示。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的各因素水平及主效應(yīng)分析Table 3 Factors,levels and main effects analysis of Plackett-Burman design

由表3可知，發(fā)酵溫度、葡萄糖添加量、轉(zhuǎn)速的P值分別為0.005、0.006、0.016，均＜0.05，因此，發(fā)酵溫度、葡萄糖添加量和轉(zhuǎn)速這3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均達(dá)到顯著水平，在所選因素中對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大。發(fā)酵溫度與轉(zhuǎn)速具有正效應(yīng)，葡萄糖具有負(fù)效應(yīng)。因此，選擇發(fā)酵溫度、葡萄糖添加量和轉(zhuǎn)速設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)是確定逼近中心點(diǎn)的顯著影響因素的取值以及提高M(jìn)DH的產(chǎn)量，發(fā)酵溫度、葡萄糖添加量、轉(zhuǎn)速這3個(gè)因素的變化方向和步長的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。由表4可知，3個(gè)顯著影響因素的中心點(diǎn)在第2組試驗(yàn)附近，因此確定第2組的水平作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即發(fā)酵溫度25℃、葡萄糖添加量10 g/L、轉(zhuǎn)速150 r/min。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用上述Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，基于PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)確定的3因素3水平，以MDH酶活（Y）作為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，相關(guān)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5～表7。

表5 菌株XJH-11產(chǎn)蘋果酸脫氫酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 5 Factors and levels of response surface experiments for malic dehydrogenase production conditions optimization by strain XJH-11

表6 菌株XJH-11產(chǎn)蘋果酸脫氫酶條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments for malic dehydrogenase production conditions optimization by strain XJH-11

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of the quadratic model

由表7可知，所選回歸模型的P值＜0.01，表明整體模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有極顯著的影響，具有可信度；失擬項(xiàng)的P值為0.058 5＞0.05，失擬項(xiàng)的檢驗(yàn)不顯著，模型選擇適當(dāng)。該模型的決定系數(shù)R2為0.9641，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9179，表明模型可信度很高。MDH酶活性（Y）對(duì)發(fā)酵溫度（A）、葡萄糖添加量（B）、轉(zhuǎn)速（C）的多元二次方程為：Y=43.67+3.85A+3.02B+3.71C-2.50AB+1.25AC-2.15BC-5.15A2-8.04B2-4.89C2。該回歸方程可用于代替試驗(yàn)實(shí)際點(diǎn)進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)[22-24]。

利用Design-Expert8.0.6軟件繪制響應(yīng)面曲線圖，結(jié)果見圖12。由圖12可知，經(jīng)軟件分析，響應(yīng)值存在最大值，得出最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度27.04℃，葡萄糖添加量10.2 g/L，轉(zhuǎn)速154.18r/min，軟件分析預(yù)測(cè)最大酶活為45.34U/mL。為了便于試驗(yàn)操作，將發(fā)酵條件修改為發(fā)酵溫度27℃，葡萄糖添加量10g/L，轉(zhuǎn)速150r/min。在此條件下進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均酶活為43.67 U/mL，接近理論值，表明響應(yīng)面法得到的最佳條件準(zhǔn)確可靠。優(yōu)化后的酶活比優(yōu)化前的22.07 U/mL提高了197.87%。

圖12 發(fā)酵溫度、葡萄糖添加量和轉(zhuǎn)速交互作用對(duì)蘋果酸脫氫酶活力影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.12 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,glucose addition and shaking speed on MDH activity

3 結(jié)論

本研究以單因素為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)墓畫大洋芽孢桿菌（Oceanobacillus picturae）XJH-11產(chǎn)MDH發(fā)酵條件進(jìn)行研究，得到最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10 g/L、酵母膏20 g/L、硫酸鎂0.1 g/L、初始pH值為8.0，最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度27℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、接種量5%、裝液量125 mL/500 mL。在此優(yōu)化條件下，MDH酶活為43.67 U/mL，比優(yōu)化前提高了197.87%。