基于多指標(biāo)評(píng)價(jià)技術(shù)研究云南不同產(chǎn)地瑪咖的質(zhì)量

侯朝祥,李智敏,李 東,王瀚墨,田 浩,呂新華,潘 俊*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學(xué)，云南 昆明 650091；3.云南良旺生物科技有限公司，云南 昆明 650000)

【研究意義】瑪咖(LepidiummeyeniiWalp.)為十字花科獨(dú)行菜屬1年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯海拔3500 m以上的安第斯山區(qū)，具有長(zhǎng)期的種植和食用歷史[1]?，斂ё鰹橐环N營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦。云南于2002年引種成功，目前已在昭通、麗江、香格里拉等地區(qū)形成規(guī)模種植。2011年中國(guó)正式批準(zhǔn)瑪咖為新資源食品，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)瑪咖的營(yíng)養(yǎng)成分，化學(xué)成分和藥理作用的深入研究，以瑪咖為原料開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上備受關(guān)注[2]。但是，近年來(lái)由于消費(fèi)者對(duì)瑪咖的盲目追捧以及商家的過(guò)分炒作，導(dǎo)致云南各地出現(xiàn)瑪咖種植亂象，瑪咖質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重制約了瑪咖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】現(xiàn)代研究表明，瑪咖多糖具有顯著的抗疲勞[3]、抗氧化作用[4]；瑪咖生物堿能全面調(diào)理人體機(jī)能，平衡內(nèi)分泌[5]，具有抗氧化、抗腫瘤[6]及提高動(dòng)物成熟卵泡小體的數(shù)量和精子的質(zhì)量，從而顯著提高哺乳動(dòng)物的生育能力[7]；瑪咖酰胺作為瑪咖的特征性成分，具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等生物活性[8-11]，其中芐基-十六烷酰胺具有抗疲勞作用[12]，但瑪咖酰胺改善性功能的作用目前仍有爭(zhēng)議[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，瑪咖來(lái)源廣泛但質(zhì)控手段單一，因此本研究以瑪咖的主要化學(xué)物質(zhì)(瑪咖多糖、瑪咖總生物堿及瑪咖酰胺)為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)多指標(biāo)技術(shù)對(duì)云南不同產(chǎn)區(qū)瑪咖質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為云南瑪咖的品質(zhì)評(píng)估提供參考依據(jù)，為統(tǒng)一瑪咖品質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)云南瑪咖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

表1 瑪咖樣品的來(lái)源信息

1 材料與方法

1.1 供試材料

瑪咖樣品于2017年11-12月采自云南10個(gè)不同的產(chǎn)區(qū)，樣品來(lái)源見(jiàn)表1?，斂悠肪鶠辄S瑪咖，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定?，斂悠窌窀珊蠓鬯檫^(guò)60目篩，置干燥器中備用。烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)：302-27-2，純度98 %)由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供；芐基-亞麻酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，芐基-亞油酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，芐基-十六烷酰胺標(biāo)準(zhǔn)品均由云南省藥檢所提供；表1中海拔、氣溫、降水量、日照數(shù)均為2017年記錄的平均數(shù)據(jù)。

1.2 儀器與設(shè)備

戴安U-3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)，AL104-IC電子分析天平(瑞士梅特勒公司)，T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(云南悅分環(huán)境檢測(cè)有限公司)，ELGA PURELAB Ultra MK2純水機(jī)(英國(guó)埃爾格公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 瑪咖中多糖含量測(cè)定 對(duì)照品溶液制備：取無(wú)水葡萄糖適量，精密稱定，加水制成濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

供試品溶液制備：精密稱定待測(cè)瑪咖粉末0.2 g，加水12 mL，超聲提取30 min，離心分離上清液，沉淀加水12 mL超聲再提30 min，離心合并上清液后定容置200 mL容量瓶中。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水至2 mL，迅速精密加入0.2 %蒽酮-硫酸溶液8 mL，搖勻，沸水浴15 min，置冰浴中冷卻5 min，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為A=2.3386C+0.1034，線性關(guān)系R2=0.9991，葡萄糖在0.025～0.4 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。

含量測(cè)定：精密量取1 mL置10 mL具塞試管中，加水至2 mL。精密加入0.2 %蒽酮-硫酸溶液8 mL，搖勻，沸水浴15 min，置冰浴中冷卻5 min，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以無(wú)水葡萄糖含量計(jì)算總多糖含量[14]。

1.3.2 瑪咖中生物堿的含量測(cè)定 對(duì)照品溶液制備：取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加氯仿制成濃度為1.0 mg/mL的烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)液。

供試品溶液制備：精密稱定待測(cè)瑪咖粉末0.1 g，加氯仿12 mL，超聲提取40 min，過(guò)濾，即得。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取對(duì)照品溶液0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2 mL，加氯仿定溶至5 mL，分別加入7.0 mL 2.0×10-4mol/L的溴百里香酚藍(lán)顯色劑，密塞振蕩2 min，靜置1.5 h，吸取氯仿層4.0 mL，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，烏頭堿濃度(C)為橫坐標(biāo)，得到回歸方程為A=35.42C-0.021，線性關(guān)系R2=0.997，烏頭堿在0.005～0.04 mg/g質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

含量測(cè)定：精密量取供試品溶液1.0 mL，加氯仿定溶至5 mL，再加入7.0 mL 2.0×10-4mol/L的溴百里香酚藍(lán)顯色劑，密塞振蕩2 min，靜置1.5 h，吸取氯仿層4.0 mL，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總生物堿含量[15]。

1.3.3 瑪咖酰胺含量測(cè)定 色譜條件：色譜柱(Zorbax XDB C-18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫40 °C，流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。流動(dòng)相A-0.005 % ACN，B- 0.005 % TFA。梯度洗脫(0～35 min, 55 %～90 %A; 35～40 min 90 %～100 %A; 40～45 min 100 % A，進(jìn)樣20 μl。

對(duì)照品溶液制備：取芐基-亞麻酰胺、芐基-亞油酰胺、芐基-十六烷酰胺標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，配制標(biāo)準(zhǔn)液，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。芐基-亞麻酰胺濃度為0.49、1.225、2.45、5.12、9.8 μg/mL；芐基-亞油酰胺濃度為0.475、1.1875、2.375、4.75、7.125 μg/mL；芐基-十六烷酰胺濃度為0.49、1.225、2.45、4.9、7.35 μg/mL。

供試品溶液制備：精密稱定待測(cè)瑪咖粉末2.0 g，加甲醇10 mL，超聲提取60 min，離心取上清液定容至10 mL，過(guò)濾，即得。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別精密量取不同濃度對(duì)照品溶液20 μl進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。芐基-亞麻酰胺的回歸方程為Y=10.928X+1.8915 (R2=0.999)，芐基-亞麻酰胺在0.49 ～ 9.8 μg/mL間與峰面積具有良好線性關(guān)系；芐基-亞油酰胺的回歸方程為Y=10.928X+1.8915 (R2=0.999)，芐基-亞油酰胺在0. 475～7.125 μg/mL與峰面積具有良好線性關(guān)系；芐基-十六烷酰胺的回歸方程為Y=13.032X-0.1672(R2=0.9998)，芐基-十六烷酰胺在0.49 ～7.35 μg/mL間與峰面積具有良好線性關(guān)系[16]。

(1)：芐基-亞麻酰胺；(2)：芐基-亞油酰胺；(3)：芐基-十六烷酰胺(1): N-benzyl-9Z,12Z,15Z-octadecatrienamide; (2):N-benzyl-9Z,12Z-octadecadienamide; (3):N-benzyl-hexadecanamide圖1 瑪咖酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu) Fig.1 Chemical structures of macamide

含量測(cè)定：精密量取供試品溶液20 μl進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算芐基-亞麻酰胺、芐基-亞油酰胺、芐基-十六烷酰胺的含量。對(duì)照品與供試品HPLC見(jiàn)圖2。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 2016對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

表2 不同產(chǎn)地瑪咖中多糖的測(cè)定結(jié)果(x±s,n=3)

Table 2 Determination results of polysaccharide in Maca from different regions(x±s,n=3)

編號(hào)No.產(chǎn)地Regions多糖(%)PolysaccharideS1德欽縣 8.6±0.38aS2維西縣8.4±0.22aS3麗江市6.7±0.12bcS4寧蒗縣7.1±0.08bcS5大理市7.0±0.18bcS6昭通市5.6±0.18dS7會(huì)澤縣5.6±0.14dS8昆明市5.1±0.15dS9賓川縣5.70±0.23dS10紅河縣6.1±0.17bd

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表明組間比較在0.05水平上有顯著性差異，下同。F=34.359，P<0.05。

Note: Data followed by different small letters indicated significant difference at 0.05 levels between groups. The same as below.F=34.359,P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 瑪咖中多糖的含量

云南10個(gè)不同產(chǎn)地瑪咖中，德欽地區(qū)瑪咖多糖含量最高(8.6 %)，維西縣次之(8.4 %)，昆明市瑪咖多糖含量最低(5.1 %), 結(jié)果見(jiàn)表2。采用方差分析比較不同產(chǎn)地瑪咖多糖差異，結(jié)果顯示F=34.359，P<0.05，說(shuō)明不同產(chǎn)地瑪咖多糖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重比較顯示德欽縣和維西縣的瑪咖多糖較高，顯著高于其他產(chǎn)區(qū)。大理市、寧蒗縣、麗江市之間無(wú)顯著差異，但顯著高于昭通市、會(huì)澤縣、昆明市、賓川縣和紅河縣。

2.2 瑪咖中生物堿的含量

云南10個(gè)不同產(chǎn)地瑪咖中，德欽縣的總生物堿含量最高(3.18 mg/g)；寧蒗縣次之(2.97 mg/g)；大理市的總生物堿含量最少(1.01 mg/g)。采用方差分析比較不同產(chǎn)區(qū)瑪咖總生物堿差異，結(jié)果顯示F=16.390，P<0.05，說(shuō)明不同產(chǎn)區(qū)瑪咖總生物堿差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重比較顯示德欽縣、維西縣、麗江市、寧蒗縣、會(huì)澤縣的瑪咖總生物堿顯著高于大理市、昭通市、昆明市、賓川縣和紅河縣，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 瑪咖中瑪咖酰胺的含量

云南10個(gè)不同產(chǎn)區(qū)瑪咖酰胺含量的測(cè)定結(jié)果為德欽產(chǎn)區(qū)的芐基-亞麻酰胺，芐基-亞油酰胺，芐基-十六烷酰胺含量均最高，3種酰胺含量分別為1.081，0.768，0.608 mg/g，3種酰胺總量為2.46 mg/g。昭通市、昆明市、會(huì)澤縣的瑪咖中芐基-亞麻酰胺含量較少，在0.174 ～0.194 mg/g；紅河縣、昭通市的芐基-亞油酰胺含量最少(0.156～0.163 mg/g)；大理市、會(huì)澤縣的瑪咖中芐基-十六烷酰胺的含量在0.087 ～0.09 mg/g。采用方差分析比較不同產(chǎn)地瑪咖酰胺總量差異，結(jié)果顯示F=1212.757，P<0.05，說(shuō)明不同產(chǎn)區(qū)瑪咖酰胺總量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重比較顯示德欽縣的瑪咖酰胺總量最高。德欽縣、維西縣的瑪咖酰胺總量明顯高于昭通市、會(huì)澤縣、昆明市和紅河縣(表4)。

表3 不同產(chǎn)地瑪咖中總生物堿的測(cè)定結(jié)果(x±s, n=3)

注：F=16.390，P<0.05。

Note:F=16.390，P<0.05.

2.4 瑪咖中有效成分與環(huán)境條件的相關(guān)性分析

海拔、氣溫、降水量、日照數(shù)等環(huán)境因子與瑪咖中化學(xué)物質(zhì)的相關(guān)分析結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯觯瑴囟扰c瑪咖中多糖、總生物堿及酰胺總量均呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.001)；年降水量與瑪咖中多糖、酰胺總量分別呈極顯著(P<0.01)及顯著(P<0.05)的負(fù)相關(guān)關(guān)系；而海拔與瑪咖中多糖成分呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。年日照數(shù)對(duì)瑪咖中有效成分累積無(wú)顯著影響。

3 討 論

植物次生代謝產(chǎn)物的積累與外界環(huán)境(海拔、光照、氣候、土壤等)密切相關(guān)，不同植物不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物受環(huán)境因子的影響程度不一樣，植物可以通過(guò)改變自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)或者代謝途徑來(lái)適應(yīng)周圍的環(huán)境。不同來(lái)源的瑪咖中多糖、生物堿、酰胺的含量不同，所處的種植環(huán)境因素差異明顯。溫度與瑪咖中多糖、生物堿、酰胺的含量均呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明溫度對(duì)瑪咖中多糖、生物堿、酰胺的合成與累積具有抑制作用。而海拔與瑪咖中多糖、生物堿、酰胺的含量呈正相關(guān)關(guān)系，尤其是海拔與多糖成分呈顯著正相關(guān)。對(duì)比云南10個(gè)產(chǎn)區(qū)主要化學(xué)物質(zhì)的含量差異，結(jié)果表明海拔最高、溫度最低的德欽縣的瑪咖中多糖、總生物堿、總酰胺的含量均為最高，分別為8.6 %、3.18 mg/g、2.46 mg/g。其中德欽縣的瑪咖中芐基-十六烷酰胺為0.0608 %，與文獻(xiàn)報(bào)道的高海拔川產(chǎn)瑪咖中芐基-十六烷酰胺的含量相近(0.055 %～0.087 %)[17]。

表4 不同產(chǎn)地中瑪咖酰胺的測(cè)定結(jié)果(x±s, n=3)

表5 瑪咖中有效成分與環(huán)境條件的相關(guān)性分析

注：*表示兩因子間顯著相關(guān)，P<0.05；**表示兩因子間極顯著相關(guān)，P<0.01；***表示兩因子間極顯著相關(guān)，P<0.001。

Note: *meant significant correlation between two factors at 0.05 level,P<0.05; ** meant very significant correlation between two factors at 0.01 level,P<0.01, *** meant very significant correlation between two factors at 0.001 level,P<0.001.

10個(gè)產(chǎn)區(qū)的化學(xué)物質(zhì)含量差異大，海拔高于3000 m的德欽縣、維西縣的瑪咖中多糖、總生物堿、總酰胺含量顯著高于海拔低于2000 m的賓川縣、紅河縣等地區(qū)。究其原因瑪咖原產(chǎn)于南美安第斯山區(qū)，其海拔為 3500～4500 m，是一種特產(chǎn)高原植物。高海拔產(chǎn)地中主要成分含量高，表明高海拔地區(qū)適宜瑪咖生長(zhǎng)，次級(jí)代謝產(chǎn)物累積。

瑪咖在日本、美國(guó)等多個(gè)國(guó)家均有引種栽培，中國(guó)引入瑪咖種植已有10余年，目前已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)瑪咖資源的規(guī)?；N植，解決其產(chǎn)量問(wèn)題。而在瑪咖的質(zhì)量控制上，目前仍未達(dá)成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)也尚未形成，僅在地方標(biāo)準(zhǔn)中以瑪咖酰胺的含量進(jìn)行了簡(jiǎn)單分級(jí)。因此，文章通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的瑪咖中主要化學(xué)物質(zhì)含量的測(cè)定，為瑪咖種植、采收、加工等標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程的建立提供一定的參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過(guò)多指標(biāo)評(píng)價(jià)技術(shù)研究云南不同產(chǎn)地瑪咖的質(zhì)量，為制定瑪咖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)；為云南瑪咖規(guī)范化種植，提供詳細(xì)、全面的參考依據(jù)?，斂У墓δ芘c其化學(xué)物質(zhì)的種類和含量密切相關(guān)，瑪咖化學(xué)物質(zhì)含量的差異，決定了瑪咖品質(zhì)的好壞。云南不同產(chǎn)地的瑪咖主要化學(xué)物質(zhì)(瑪咖酰胺、總生物堿、瑪咖多糖)有顯著差異，德欽、維西地區(qū)的瑪咖品質(zhì)明顯優(yōu)于其他產(chǎn)區(qū)，這與其產(chǎn)地的海拔和溫度密切相關(guān)。研究結(jié)果為云南瑪咖質(zhì)量評(píng)估的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)，為統(tǒng)一瑪咖品質(zhì)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，對(duì)云南瑪咖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。