復方中藥腦心通提高THP-1細胞活力的作用研究

鄧子亮 陳瓊香 郭洪勝 鄭采婷 李婉怡 周雅賢 梁艷君 王森 王焱2，（通訊作者）

（1 廣東醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 廣東 東莞 523808）

（2 廣東醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院 廣東 東莞 523808）

（3 東莞常安醫(yī)院心血管內科 廣東 東莞 523000）

在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生中，炎癥反應及單核/巨噬細胞分泌的大量炎癥因子發(fā)揮重要作用[1]。巨噬細胞吞噬膽固醇后，轉化為泡沫細胞，導致溶酶體破壞，并釋放炎癥因子，進一步誘導炎癥細胞浸潤和活化，加劇AS的發(fā)生。中藥制劑腦心通（naoxintong，NXT）廣泛應用于心、腦血管疾病和缺血性疾病，具有抗凝、抗炎、抗氧化、保護內皮、改善微循環(huán)、穩(wěn)定斑塊等作用[2]，還可增強機體細胞免疫力及清除自由基[3]，在AS的防治中具有較好的應用前景。人急性單核細胞白血病THP-1細胞在白血病、AS等疾病研究中均有應用，本課題組就NXT對THP-1細胞活力的影響及其作用特點展開實驗研究，為進一步研究腦心通防治AS，開發(fā)傳統(tǒng)中藥NXT的新用途提供實驗基礎。

1.資料與方法

1.1 材料與儀器

THP-1細胞由廣東醫(yī)科大學生化教研室張志珍教授贈送；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，11875）、胎牛血清（美國Gibco公司，10270）；腦心通（陜西步長制藥有限公司）； CCK8（日本同仁化學研究所，LH646）；DMSO（D8370），離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，TGL-16 L400）、Thermofisher 160i二氧化碳培養(yǎng)箱、BIO-RAD iMark酶標儀、寧波舜宇XD30倒置熒光顯微鏡、超凈工作臺、廣州諾爾路生物科技有限公司MX-RD-E混勻器。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細胞的培養(yǎng) THP-1細胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640。每 2～3d傳代1次，選用對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 腦心通藥物稀釋液的制備 將腦心通膠囊中的粉末稱重，按照0.1g/ml的質量體積比加入DMSO或無水乙醇（EtOH），室溫下于混勻器搖動浸取12h。2500rpm離心20min，取其上清為原液，分裝-20℃保存。用無血清培養(yǎng)基倍比稀釋成工作濃度（確保使用終濃度中的DMSO不超過1/1000）。

1.2.3 CCK8法檢測細胞活力 收集處于對數(shù)生長期的THP-1細胞，以每孔2×l04個細胞接種于96孔板。各組設3復孔，按如下實驗設計處理后，于細胞培養(yǎng)箱中孵育后，每孔加入10μl CCK8試劑，37℃避光反應2～3h后，450nm波長（參比630nm）檢測每孔的吸光度值，根據(jù)公式計算細胞活力。

細胞活力=[（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）]×100%。

1.2.4 不同溶劑對細胞活力影響實驗 設空白組：只含培養(yǎng)基無細胞和藥物、DMSO對照組（Negative）：1/1000（終濃度，下同）的DMSO、DMSO實驗組（NXT）：1/1000的NXTDMSO浸取液、EtOH對照組（Negative）：1/1000EtOH和EtOH實驗組(NXT)：1/1000的NXT-EtOH浸取液，細胞培養(yǎng)箱中孵育3h后檢測。不同稀釋度的NXT對細胞活力影響實驗設DMSO對照組（0）：DMSO 1/1000，實驗組：NXT浸取液作用細胞的稀釋度分別為1/100，1/1000和1/10000，細胞培養(yǎng)箱中孵育3h后檢測。

NXT不同作用時間對細胞活力影響實驗 設DMSO對照組（0）：DMSO 1/1000，實驗組：NXT浸取液作用細胞的稀釋度為1/1000，分別作用1h、4h、8h和12h后檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

計量資料以平均值±標準差表示，兩組組間差異用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 NXT的不同溶劑浸取液的作用效果

CCK8法檢測終濃度為1/1000的NXT浸取液對細胞活力的影響，結果顯示(Fig 1）：與溶劑對照（Negative）組比較，NXTDMSO浸取液可顯著提高細胞活性至115.84%±3.22%（P=0.023）,而NXT-EtOH 浸取液對細胞活力的提高沒有顯著效果。

2.2 NXT提高THP-1細胞活力的劑量效應

將不同的終濃度的NXT-DMSO浸取液作用于細胞3小時后，可觀察到(Fig 2）：和溶劑組（0組）相比較，1/10000稀釋的NXT對細胞活力的提高作用有限，終濃度1/1000的藥物提高細胞活力的效果最佳（P＜0.05）；繼續(xù)增加藥物濃度，可觀察到細胞活性迅速降低，1/100稀釋的藥物組的細胞活力僅為48.19%±7.29%（P＜0.001）。

2.3 NXT提高THP-1細胞活力的時間效應

將終濃度為1/1000的NXT-DMSO浸取液作用細胞不同時間后，CCK8法檢測細胞活力結果(Fig 3）：和溶劑組（0）相比較，NXT作用1h即可有效提高THP-1細胞活力（P＜0.01），作用4h效果最佳（P＜0.001），藥效可持續(xù)到接近8h（P=0.058）。

Fig 1 NXT的不同溶劑浸取液對THP-1細胞活力的提高作用比較（P為NXT組與對照（Negative）組比較的t檢驗結果，n=3）。

Fig 2 不同稀釋度的NXT對THP-1細胞活力的提高作用比較（NXT組與對照（0）組比較，*表示P＜0.05，***表示P＜0.001，n=3）。

Fig 3 NXT做用不同時間對THP-1細胞活力的提高作用比較（NXT組與對照（0）組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3）

3.討論

AS是一種由多因素共同作用引起的全身性疾病，動脈脂質沉積、平滑肌細胞和基質纖維化等因素促進動脈粥樣斑塊的形成。單核細胞受到CCR2/ MCP-1等多種趨化因子募集遷移，黏附到活化的血管內皮細胞，浸潤到內膜下層，可轉變成巨噬細胞。同時垂體前葉及外周單核巨噬細胞分泌的巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）在AS發(fā)生中也起到重要作用[4]。MIF可抑制巨噬細胞的游走，同時促進其局部浸潤、活化及分泌炎癥因子促進AS發(fā)生。巨噬細胞吞噬膽固醇等脂質后，轉變成泡沫細胞，進一步促進AS斑塊的形成[5]。

腦心通是“腦心同治”理論的代表性現(xiàn)代中藥方劑，由黃芪66g，赤芍27g，丹參27g，當歸27g，川芎27g，桃仁27g，紅花13g，醋乳香13g，醋沒藥13g，雞血藤20g，牛膝27g，桂枝20g，桑枝27g，地龍27g，全蝎13g，水蛭27g共16味中藥組成[6]。臨床上，腦心通具有益氣活血、化瘀通絡的作用，主要用于治療冠心病、心絞痛、腦卒中等心腦血管疾病。近年隨著國家對大力推進中醫(yī)藥繼承與創(chuàng)新，腦心通的二次開發(fā)取得明顯進展：其在治療糖尿病慢性并發(fā)癥、原發(fā)性高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化以及腰椎間盤突出等癥等方面都有較好的效果[7]。

本結果顯示，腦心通可提高單核細胞系THP-1細胞的活力，對細胞有一定的保護作用，與劉倩等人的研究結果一致[8]。腦心通中的黃芪多糖能抑制THP-1細胞分泌TNF-α，減緩巨噬-泡沫細胞的形成[9]；川芎有擴張血管、抑制炎癥反應的作用[10]；丹參有降脂、抗炎等多種作用[11]。這提示我們腦心通可能通過抑制炎癥因子分泌，減輕炎癥反應，進而對單核細胞的活力有一定的保護作用，這也與腦心通通過抗炎來減緩動脈粥樣硬化的機制相一致。今后，我們將就腦心通的抗炎效應在AS發(fā)生中的作用展開深入研究。

我們進一步發(fā)現(xiàn)，腦心通在1h就能基本達到最佳藥效，有效作用時間接近8h，顯示出較其有效成分吸收迅速，有效時間窗較寬。結果表明，1/100稀釋的腦心通浸取液對細胞活性表現(xiàn)出較強的抑制效果，這提示高濃度的腦心通對細胞有一定的毒副作用，與李偉霞等論文[7]顯示腦心通可引起一定的惡心、嘔吐等不良反應相一致。

綜上所述，結果顯示出腦心通對單核細胞系的保護作用及其作用規(guī)律，為進一步研究提供了基礎。也提示，盡管傳統(tǒng)方藥腦心通已經(jīng)在臨床尚廣泛應用，其藥理機制、作用機理及新的用途尚需更深入的研究。