沉默DCR3表達(dá)增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的實(shí)驗(yàn)研究

王芳蘭 李玉山 崔彥虎

(1平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅 平?jīng)?744000；2涼州中醫(yī)醫(yī)院普外科；3平?jīng)鍪腥嗣襻t(yī)院麻醉科)

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年有超過20萬的新增卵巢癌患者，其臨床表現(xiàn)較為隱匿，病理類型較為復(fù)雜，有超過50%的患者在確診時(shí)已經(jīng)處于卵巢癌晚期，手術(shù)治療、化療、基因靶向治療等是目前常見的卵巢癌的治療手段，尋找有效的靶基因提高卵巢癌對(duì)化療藥物的敏感性是目前研究的熱點(diǎn)〔1〕。誘騙受體(DCR)3是一種腫瘤壞死因子的受體，在人體的胚胎、肝臟等組織中表達(dá)水平較低，可以調(diào)控細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、凋亡等過程，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔2，3〕。研究顯示，DCR3在多種腫瘤組織如肺癌、胃癌等中過度表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過程〔4～6〕。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒干擾下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中DCR3的表達(dá)，探討沉默DCR3對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡及紫杉醇敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1材料 卵巢癌細(xì)胞ES-2購自BNCC細(xì)胞庫；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(C-Caspase)-12抗體、DCR3抗體購自加拿大PLLABS；RNA提取試劑盒購自北京solarbio；綠色熒光蛋白(GFP)靶向DCR3慢病毒干擾載體由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；紫杉醇購自美國Caibioclem；Realtime PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；C-Caspase-3、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)抗體購自美國ABCM。

1.2紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖影響 ES-2細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液中添加1%的青鏈霉素，細(xì)胞培養(yǎng)條件為：飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱，溫度為37℃。ES-2細(xì)胞種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入3 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜以后，將培養(yǎng)液吸除，加入含有0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L紫杉醇的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h以后，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，在每孔內(nèi)加入10 μl的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)，放在37℃結(jié)合4 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的OD值。以不含細(xì)胞的空白孔調(diào)零以后，把0 mol/L紫杉醇處理的細(xì)胞存活率計(jì)為100%，分析不同濃度紫杉醇處理后卵巢癌細(xì)胞存活率變化。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 ES-2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期以后，用胰蛋白酶消化，種植到6孔板內(nèi)，細(xì)胞融合度為30%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染，在細(xì)胞中添加感染復(fù)數(shù)(MOI)=20的病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換成新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。3 d后，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體上GFP熒光表達(dá)水平，感染效率高于80%繼續(xù)培養(yǎng)。將穩(wěn)定感染靶向DCR3慢病毒干擾載體和對(duì)照載體的ES-2細(xì)胞記為干擾組、對(duì)照組，用Realtime PCR和Western印跡檢測(cè)干擾效果。把給予10-6mol/L紫杉醇處理穩(wěn)定感染靶向DCR3慢病毒干擾載體和對(duì)照載體的ES-2細(xì)胞記為紫杉醇組、紫杉醇+干擾組。

1.4Realtime PCR檢測(cè)DCR3表達(dá)水平 取對(duì)照組、干擾組，按照RNA提取試劑盒說明書將細(xì)胞中的總RNA分別提取，在-80℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA合成，步驟同試劑盒說明書，cDNA保存在-80℃。Realtime PCR試劑盒分析DCR3水平，讀取內(nèi)參β-actin和目的基因DCR3的Ct值，按照2-△△CT計(jì)算。Realtime PCR程序設(shè)置：94℃，5 min(94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，10 min)×40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：DCR3上游5′-CTCTTCCTCCCATGACAC-3′，下游5′-CTGGA-AAGCCACAAAGTC-3′。β-actin上游5′-CGTGAAA-AGATGACCCAGATCA-3′，下游5′-CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5Western印跡檢測(cè)DCR3表達(dá)水平 取對(duì)照組、干擾組，常規(guī)方法提取細(xì)胞中的蛋白，蛋白分裝后保存在-20℃。以二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組蛋白樣品的濃度。按照每個(gè)上樣孔中加入30 μg蛋白進(jìn)行電泳，上樣前同1/4體積的5倍上樣緩沖液混合后，在100℃煮沸5 min。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中電壓為：濃縮膠中72 V，觀察溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠和濃縮膠交接處后，將電壓調(diào)高至120 V繼續(xù)電泳，直到觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入膠塊下端邊緣約1 cm時(shí)，停止電泳。凝膠在80 V電壓條件下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜置于冰水混合物上進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min。用5%的牛血清白蛋白將電轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素(NC)膜封閉以后，同1∶500倍稀釋后的DCR3抗體在4℃過夜反應(yīng)，再與1∶2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在室溫孵育2 h后，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，檢測(cè)各組目的蛋白DCR3和內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值，以二者的比值表示DCR3蛋白水平。

1.6細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 對(duì)照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組按照上述方法處理后，按照每個(gè)孔內(nèi)加200個(gè)細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)14 d，期間每3 d進(jìn)行換液1次。把孔內(nèi)的液體吸除以后，以多聚甲醛固定以后，滴加吉姆薩染液，染色20 min。觀察計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)目，以細(xì)胞克隆數(shù)目占接種細(xì)胞數(shù)目的百分比作為克隆形成率。按照對(duì)照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組分組處理細(xì)胞，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞48 h增殖情況，步驟同1.2。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組按照上述方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化，用磷酸鹽緩沖液(PBS)制成單細(xì)胞懸浮液，離心后，棄上清，添加200 μl結(jié)合緩沖液懸浮各組細(xì)胞，加入碘化丙啶(PI)、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC各5 μl，置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡變化。

1.8Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平 對(duì)照組、干擾組、紫杉醇組、紫杉醇+干擾組按照上述方法處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以Western印跡方法測(cè)定細(xì)胞中C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平，C-Caspase-12、C-Caspase-3抗體以1∶400稀釋，CHOP抗體以1∶200稀釋。步驟同1.5。

1.9統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1紫杉醇抑制卵巢癌細(xì)胞增殖 紫杉醇濃度：0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的細(xì)胞存活率分別為100.00%、(90.15±7.86)%、(76.82±6.38)%、(53.26±4.15)%、(34.15±2.17)%。不同濃度紫杉醇處理后的卵巢癌細(xì)胞的存活率逐漸降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，10-6mol/L的紫杉醇處理后的卵巢癌細(xì)胞存活率約為50%，后續(xù)選用10-6mol/L的紫杉醇處理卵巢癌細(xì)胞。

2.2慢病毒感染效果檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，干擾組細(xì)胞中DCR3 mRNA和蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)。構(gòu)建了DCR3表達(dá)下調(diào)的卵巢癌細(xì)胞。見表1，圖1。

表1 兩組DCR3 mRNA和蛋白水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

圖1 Western印跡檢測(cè)DCR3表達(dá)

2.3各組細(xì)胞存活率及克隆形成率比較 與對(duì)照組比較，干擾組、紫杉醇組及紫杉醇+干擾組細(xì)胞存活率及克隆形成率均顯著降低(P<0.05)。與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾組細(xì)胞存活率及克隆形成率均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.4各組細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組〔(6.23±0.52)%〕比較，干擾組、紫杉醇組及紫杉醇+干擾組細(xì)胞凋亡率均顯著升高〔(24.15±2.13)%、(32.52±2.89)%、(46.10±3.27)%；均P<0.05〕。與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

表2 各組卵巢癌細(xì)胞存活率和細(xì)胞克隆形成率

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與紫杉醇組比較：2)P<0.05；下表同

圖2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率

2.5各組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，干擾組、紫杉醇組及紫杉醇+干擾組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平顯著升高(均P<0.05)；與紫杉醇組比較，紫杉醇+干擾組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 Western印跡檢測(cè)C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平

表3 各組C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平比較

3 討 論

DCR3基因定位在人類的20q13.3染色體上，該染色體上多個(gè)基因的擴(kuò)增與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，DCR3在胃、脊髓、脾臟等組織中廣泛低表達(dá)，而在腫瘤中過度表達(dá)〔7，8〕。DCR3基因的cDNA編碼的蛋白質(zhì)含有300多個(gè)氨基酸，其N端含有一個(gè)信號(hào)肽序列，在信號(hào)肽序列之后有4個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，其在細(xì)胞增殖、凋亡等中具有重要作用〔9〕。目前在肺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)DCR3過度表達(dá)，并且沉默其表達(dá)后還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，下調(diào)腫瘤細(xì)胞的增殖能力〔10～12〕。DCR3在卵巢癌組織中過表達(dá)，其表達(dá)水平的高低與腫瘤患者年齡等無關(guān)，與腫瘤患者的臨床分期、組織分化程度等有關(guān)，DCR3可能是卵巢癌治療的潛在靶點(diǎn)〔13，14〕。本研究顯示，沉默DCR3后的卵巢癌細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞克隆能力均降低，說明沉默DCR3發(fā)揮卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，這與上述研究類似，均表明沉默DCR3抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

紫杉醇主要是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種二萜類化合物，目前廣泛用于乳腺癌、卵巢癌等十幾種腫瘤的臨床治療中〔15，16〕。紫杉醇具有較好的抗腫瘤效果，其可以通過抑制細(xì)胞的有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用〔17〕。靶向基因增加紫杉醇敏感性是目前研究的重點(diǎn)，也是提高腫瘤治愈率的重要途徑〔18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫杉醇處理后的卵巢癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡水平升高，說明紫杉醇具有在體外抑制卵巢癌細(xì)胞的作用，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，靶向DCR3沉默后的卵巢癌經(jīng)紫杉醇處理后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，細(xì)胞增殖能力下降更多，說明靶向DCR3沉默可以在體外提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，DCR3可能是提高卵巢癌紫杉醇敏感性的潛在靶點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程，其發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年來發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑〔19〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)膽固醇等合成、折疊的重要場(chǎng)所，蛋白質(zhì)正確折疊是保證細(xì)胞正常功能發(fā)揮的重要途徑，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到外界因素的刺激以后，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白CHOP大量表達(dá)，誘導(dǎo)Caspase-12活化，引起細(xì)胞凋亡發(fā)生〔20～22〕。Caspase-12定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外膜，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中被激活，而與其他凋亡途徑無關(guān)〔23～25〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默DCR3后的卵巢癌細(xì)胞經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)以后，細(xì)胞中Caspase-12的活化水平升高，細(xì)胞中CHOP蛋白含量升高，同時(shí)細(xì)胞中凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3的活化水平也升高，提示靶向DCR3協(xié)同紫杉醇通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

綜上，靶向DCR3可能是提高卵巢癌紫杉醇敏感性的途徑之一，其可以協(xié)同紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這為提高腫瘤化療敏感性提供了新思路，對(duì)于提高卵巢癌患者治愈率具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)只在1株卵巢癌細(xì)胞中進(jìn)行了初步探討，后續(xù)會(huì)在多株細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，并且會(huì)對(duì)其具體的作用機(jī)制進(jìn)行探索。