瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調(diào)控

董建設(shè) 趙俊峰 張林超 陳瑞廷 賈占奎 楊錦建

(1河南省中醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科)

腎細(xì)胞癌(RCC)又稱腎癌，是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，起源于腎實(shí)質(zhì)，多發(fā)生于中老年人，男性患者多于女性。近年來(lái)腎癌患病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)〔1〕。腎癌治療方式以手術(shù)切除輔以放化療的綜合治療方式為主，但放化療對(duì)患者產(chǎn)生較大的副作用，且患者易產(chǎn)生放射不敏感性及耐藥性，大大影響后期放化療效果〔2,3〕。因此，尋找新的治療方式對(duì)于改善腎癌的治療現(xiàn)狀顯得尤為重要。近年來(lái)采用中藥輔助治療腫瘤的研究成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)〔4〕。瞿麥?zhǔn)鞘駥僦参铮莻鹘y(tǒng)的中藥材，具有破骨涌經(jīng)、清熱、利尿的功效。研究表明，瞿麥具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用〔5,6〕。從瞿麥中分離出的環(huán)肽化合物對(duì)肝癌、乳腺癌、肺癌具有較好的抗腫瘤作用〔7〕；從瞿麥中分離的黃酮類化合物可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人體表皮細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡〔8〕，還可抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖〔9〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)瞿麥干預(yù)腎人癌細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響進(jìn)行研究，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料 人腎癌細(xì)胞786-0購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；瞿麥根提取物購(gòu)于蘭州沃特萊斯生物科技有限公司，純度為99%；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司合成；BCA蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物購(gòu)于上海炎熙生物科技有限公司；鈣黏附蛋白E(E-cadherin)單抗、神經(jīng)性鈣黏附素(N-cadherin)單抗和波形蛋白(Vimentin)單抗均購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司。

1.2腎癌細(xì)胞培養(yǎng) 人腎癌細(xì)胞786-0培養(yǎng)用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、飽和濕度、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT檢測(cè)腎癌細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為3×103個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，去除原培養(yǎng)基，添加含不同濃度的瞿麥根提取液的培養(yǎng)液，各組對(duì)應(yīng)濃度分別為0.0 μg/ml、12.5 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml、100.0 μg/ml，每組設(shè)置5個(gè)平行復(fù)孔。在加入含瞿麥的培養(yǎng)基后24、48 h時(shí)，分別在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入0.5 mg/ml的MTT溶液200 μl，置于37℃條件下繼續(xù)孵育4 h。吸取上清后，再在每孔中加入二甲基亞砜 100 μl，緩慢搖動(dòng)孵育10 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A值)。計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。以0.0 μg/ml組測(cè)得的A值為對(duì)照計(jì)算百分比，抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎癌細(xì)胞凋亡率 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組(0 μg/ml組)、藥物組(分別給予50 μg/ml、100 μg/ml濃度的瞿麥處理腎癌細(xì)胞)。待細(xì)胞處理48 h后，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整各組細(xì)胞量約為1×105個(gè)，加入Annexin V-FITC 5 μl混勻后，再加入PI 5 μl，于室溫下反應(yīng)15 min后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組腎癌細(xì)胞凋亡率。

1.5qRT-PCR檢測(cè)腎癌細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)水平 各組腎癌細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h以后，按照Trizol提取RNA試劑盒提取各組腎癌細(xì)胞總RNA，提取的RNA經(jīng)濃度和純度檢測(cè)，A260/A280值為1.98，保證了RNA提取的完整性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用碧波逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，采用20 μl反應(yīng)體系〔SYBR Green 10 μl，cDNA模板4 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)-H2O 4 μl〕，反應(yīng)為40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為參照，用相對(duì)定量2-△△CT分析Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎癌細(xì)胞遷移能力 用記號(hào)筆在細(xì)胞培養(yǎng)板底部均勻劃數(shù)條橫線，保證所劃?rùn)M線穿過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)孔。將各組處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的腎癌細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，以無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，用滅菌過(guò)的100 μl移液槍槍頭垂直于橫線劃出均勻的細(xì)胞劃痕，用PBS洗滌劃下的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，加入含10%血清的培養(yǎng)液，加入相應(yīng)濃度的瞿麥(終濃度為50 μg/ml和100 μg/ml)，于劃痕48 h后，在劃痕處拍照記錄細(xì)胞遷移結(jié)果。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎癌細(xì)胞侵襲能力 在Transwell小室的聚碳酸酯膜上加入稀釋過(guò)的基質(zhì)膠60 μl，置超凈工作臺(tái)中使基質(zhì)膠過(guò)夜聚合重建基膜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞以PBS洗滌3次，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/L，在Transwell上室加入細(xì)胞懸液100 μl，各組細(xì)胞中加入不同濃度的瞿麥至終濃度為0、50、100 μg/ml，在下室加入含10%血清的培養(yǎng)液500 μl，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液取出小室，用棉簽拭去上室的細(xì)胞，用40 ml/L的多聚甲醛固定10 min，用1 ml/L的結(jié)晶紫染色15 min，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.8Western印跡檢測(cè)腎癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞分別加入濃度為0、50、100 μg/ml的瞿麥，培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)液后用PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔細(xì)胞中加入苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液150 μl，置冰上裂解30 min。用細(xì)胞刮把細(xì)胞刮落收集至EP管內(nèi)，10 715 r/min離心10 min收集上清。用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。每個(gè)泳道孔加入50 μg變性的蛋白樣品，以5%的濃縮膠、12%的分離膠電泳分離蛋白，以半干法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為80 V電壓，4℃轉(zhuǎn)膜120 min。以5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉60 min。分別加入E-cadherin(1∶800稀釋)、N-cadherin(1∶800稀釋)和Vimentin(1∶500稀釋)的一抗在4℃中過(guò)夜反應(yīng)，用PBS洗滌后，加入二抗在室溫中繼續(xù)孵育2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光，成像系統(tǒng)中掃描圖像，以每組腎癌細(xì)胞中GAPDH灰度值為參照，分析各組腎癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞增殖抑制的影響 隨著瞿麥濃度的升高，腎癌細(xì)胞增殖抑制率也明顯升高，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)瞿麥濃度到達(dá)100 μg/ml時(shí)，對(duì)腎癌細(xì)胞抑制率最高。隨著瞿麥作用時(shí)間的延長(zhǎng)，50 μg/ml和100 μg/ml組腎癌細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡的影響 0、50、100 μg/ml組腎癌細(xì)胞凋亡率分別為(4.52±0.51)%、(26.48±3.16)%、(57.97±6.06)%，隨著瞿麥濃度的升高，腎癌細(xì)胞凋亡率也顯著升高，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，與0 μg/ml組相比，50、100 μg/ml組細(xì)胞凋亡率顯著升高，與50 μg/ml組相比，100 μg/ml組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響 50、100 μg/ml組腎癌細(xì)胞中Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)，與0 μg/ml組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；50 μg/ml與100 μg/ml組比較，Bax、Bcl-2 mRNA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖抑制率比較

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05；與12.5 μg/ml組比較，2)P<0.05；與25 μg/ml組比，3)P<0.05；與50 μg/ml組比，4)P<0.05；與同濃度24 h比較：5)P<0.05

表2 不同濃度瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞中Bax和Bcl-2相對(duì)表達(dá)量的影響

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05；與50 μg/ml組比較：2)P<0.05；表3、4同

2.4瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 與0 μg/ml組比較，50、100 μg/ml組遷移距離及穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)；與50 μg/ml組比較，100 μg/ml組遷移距離及穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同濃度瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力的影響

2.5瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平的影響 與0 μg/ml組比較，50、100 μg/ml組顯著抑制N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，隨著瞿麥濃度的增加，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平逐漸降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平逐漸升高，組間E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表4。

表4 不同濃度瞿麥對(duì)腎癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

腎癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)表明腎癌的發(fā)病相關(guān)的因素可能有遺傳、肥胖、吸煙及高血壓等有關(guān)，引發(fā)腎癌發(fā)生的具體分子機(jī)制目前還不十分明確〔10〕。目前治療腎癌的手段主要有手術(shù)治療、放療和化療，放療和化療毒副作用較大，而中藥不僅具有抗癌作用，毒性和不良反應(yīng)少，還可減輕患者放療和化療后的一些不良反應(yīng)，因此，中藥受到越來(lái)越多的研究者關(guān)注〔11,12〕。研究表明，從瞿麥中分離的多種活性物質(zhì)可發(fā)揮抗癌作用〔13〕。從瞿麥中分離的水楊酰胺衍生物可通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體激酶的激活，起到對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制的作用〔14〕。對(duì)瞿麥根部位采用石油醚萃取，提取的瞿麥活性物質(zhì)處理人食道癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)食道癌細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，說(shuō)明瞿麥可抑制人食道癌細(xì)胞增殖〔15〕。體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞BGC-823，用瞿麥分離物槲皮素作用于胃癌細(xì)胞，碘化吡啶染色結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瞿麥處理后腎癌細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡率升高，說(shuō)明瞿麥可抑制腎癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與上述研究類似。

細(xì)胞凋亡是由凋亡相關(guān)基因所調(diào)控的細(xì)胞自主的有序的死亡，目前研究較多凋亡相關(guān)的基因是Bax和Bcl-2〔17〕。Bax是一類促凋亡的基因，可促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，參與細(xì)胞中鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，當(dāng)Bax表達(dá)量增多往往導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔18〕。Bcl-2是一種抗凋亡基因，通常與Bax形成二聚體，當(dāng)Bcl-2的表達(dá)減少時(shí)，Bax /Bcl-2比值升高，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔19〕。對(duì)瞿麥有效活性物質(zhì)提取后處理人胃癌細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀和Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中半胱天冬酶以及Bax和Bcl-2基因表達(dá)量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)半胱天冬酶和Bax發(fā)生上調(diào)，Bcl-2發(fā)生下調(diào)〔20〕。本實(shí)驗(yàn)對(duì)瞿麥處理的腎癌細(xì)胞中Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，Bax的表達(dá)顯著升高，Bcl-2的表達(dá)明顯降低，且細(xì)胞凋亡率升高，提示瞿麥誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡與Bax和Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞之間失去接觸聯(lián)系轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞表型的一系列可逆的變化。通過(guò)EMT導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去基底膜的連接，獲得較高的侵襲和遷移能力〔21〕。EMT在癌癥轉(zhuǎn)移、慢性炎癥及多種纖維化疾病中具有重要作用。上皮細(xì)胞特異性結(jié)合蛋白即細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白表達(dá)減少，間充質(zhì)細(xì)胞特性蛋白Vimentin、N-cadherin的表達(dá)增多，導(dǎo)致EMT的發(fā)生〔22〕。目前認(rèn)為，EMT發(fā)生或減少的可靠的蛋白分子標(biāo)志是Vimentin、N-cadherin和E-cadherin〔23〕。研究表明，IL-33刺激腎癌786-0細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)786-0細(xì)胞侵襲和遷移〔24〕。瞿麥等中藥用于治療膀胱癌可抑制癌細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)散〔25〕。本研究中，用瞿麥處理腎癌細(xì)胞，細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)增加，Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)減少，說(shuō)明瞿麥抑制EMT的發(fā)生，對(duì)瞿麥干擾的腎癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力都減弱。提示瞿麥?zhǔn)峭ㄟ^(guò)抑制EMT的發(fā)生抑制腎癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

綜上，瞿麥可以抑制腎癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與Bax、Bcl-2基因及E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步研究瞿麥抗癌作用奠定基礎(chǔ)，可為腎癌的治療提供新的作用靶點(diǎn)。