藍(lán)光對(duì)老年小鼠角膜上皮組織和淚膜功能的影響

袁晴 李娟 劉康成 葉蕾 李清海 劉鈺鑫 閔幼蘭 邵毅

(1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，江西 南昌 330006；2西安市第四醫(yī)院眼科)

研究證明發(fā)光二極管(LED)會(huì)對(duì)眼部造成損傷〔1〕，包括眼表和眼底的各個(gè)組成部分，雖然可采取一定的保護(hù)措施，但仍不能完全避免其帶來(lái)的損傷〔2〕。藍(lán)光屬于LED構(gòu)成元素中的一種，波長(zhǎng)380～500 nm，用于治療新生兒黃疸〔3〕，但藍(lán)光對(duì)眼睛有害。本文旨在探討藍(lán)光對(duì)老年小鼠的淚膜和上皮細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取24只BABL/c老年雄性小鼠(體重20～25 g，24～28周齡，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，均為無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，實(shí)驗(yàn)前先在裂隙燈顯微鏡下觀察有無(wú)角膜異常，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)〔4〕。將24只老年小鼠隨機(jī)分為兩組，A組不進(jìn)行任何處理，B組持續(xù)照射藍(lán)光，分別于干預(yù)前、干預(yù)后1、4、7 d行淚液分泌測(cè)試(SIT)、淚膜破裂時(shí)間(BUT)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)第7天行角膜熒光素染色(FL)，取所有小鼠眼球做透射電鏡及切片蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察角膜上皮損傷情況。本次研究實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)要求〔5〕。

1.2藍(lán)光籠制作 鼠籠頂部安置兩根藍(lán)光燈管(波峰430 nm，半波寬約20 nm，藍(lán)光強(qiáng)度2.635 mW/cm2)，留出喂食通道，鼠籠四周貼上反光的鏡面紙，為防止燈管產(chǎn)熱對(duì)實(shí)驗(yàn)造成誤差，裝置排風(fēng)扇，底面放置墊料。

1.3SIT 首先將淚液檢查酚紅棉線(天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)剪成1.5 cm長(zhǎng)，剪棉線時(shí)注意保證邊緣整齊，以免因粗糙刺激角膜而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。左手抓穩(wěn)老年小鼠并固定頭部，使其眼瞼處于自然狀態(tài)，右手持鑷子夾住棉線一端，將另一端置于小鼠內(nèi)眥處并保持姿勢(shì)固定，15 s后取出棉線拉直，用游標(biāo)卡尺讀出棉線浸濕的長(zhǎng)度并記錄。保證由同一操作者在相同環(huán)境(溫度、濕度、時(shí)間、光照強(qiáng)度)下完成測(cè)試。

1.4BUT 參照文獻(xiàn)的方法〔6〕，將1 μl 10 g/L的熒光素鈉用移液槍滴入老年小鼠眼表，并輔助其瞬目，此刻的熒光素鈉已經(jīng)很好地附著在眼表，然后在裂隙燈顯微鏡的鈷藍(lán)光下觀察并記錄小鼠角膜染色區(qū)出現(xiàn)第一個(gè)黑斑的時(shí)間，即為淚膜破裂時(shí)間，注意移液槍的槍頭不要觸及小鼠眼表，以免造成不必要的損傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5FL 給小鼠滴1滴1%熒光素鈉滴眼液，輔助其瞬目，評(píng)分系統(tǒng)參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)〔7〕，無(wú)任何染色為0分，輕微散點(diǎn)狀著染<30個(gè)點(diǎn)為1分，點(diǎn)狀染色≥30點(diǎn)，但未發(fā)生融合為2分；浸潤(rùn)彌漫性染色，沒(méi)有斑塊為3分；有熒光素斑塊為4分。

1.6角膜HE染色 將老年小鼠的角膜制成冰凍切片，晾干，于冰丙酮中固定后沖洗，進(jìn)行HE染色3 min，著色后沖洗，放入1%鹽酸酒精中分化并沖洗，伊紅染色，漂洗，分別在70%、80%、98%、100%酒精中脫水，二甲苯透明2次，晾干，樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察老年小鼠角膜上皮細(xì)胞的情況。

1.7透射電子顯微鏡(TEM) 收獲角膜標(biāo)本并在2.5%戊二醛和4%多聚甲醛的PBS溶液(pH=7.4)中固定2 h。將角膜標(biāo)本包埋、切片和染色后用TEM顯微鏡(JEM2100HC，JEOL，Tokyo，Japan)拍攝TEM圖像。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SIT結(jié)果 干預(yù)前兩組SIT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第1天，與干預(yù)前相比兩組SIT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后4、7 d，A組與實(shí)驗(yàn)前相比SIT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B組與實(shí)驗(yàn)前相比SIT顯著降低(P<0.05)，且B組SIT明顯小于A組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組干預(yù)前后SIT比較

與干預(yù)前比較：1)P<0.05；下表同

2.2BUT結(jié)果 干預(yù)前，兩組BUT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后1 d，兩組與實(shí)驗(yàn)前相比BUT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組間BUT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后4、7 d，與實(shí)驗(yàn)前相比，B組BUT明顯降低(P<0.05)，且B組BUT明顯小于A組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組干預(yù)前后BUT比較

2.3FL結(jié)果 干預(yù)前，兩組FL評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后1 d，兩組與實(shí)驗(yàn)前相比FL評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且兩組間FL評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后4、7 d，A組與實(shí)驗(yàn)前相比，F(xiàn)L評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而B(niǎo)組出現(xiàn)大量斑塊著染，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且B組FL評(píng)分明顯大于A組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4HE染色結(jié)果 A組角膜上皮由4～6層上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞排列整齊緊密，無(wú)缺損；B組角膜上皮層數(shù)未見(jiàn)明顯增加，基底細(xì)胞層為單層柱狀上皮，角膜厚度未發(fā)生明顯改變，表層上皮未見(jiàn)脫落、損傷，表面光滑(圖1)。兩組上皮細(xì)胞層數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；A組上皮空泡細(xì)胞數(shù)顯著大于B組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表3 兩組干預(yù)前后各時(shí)段角膜FL評(píng)分分,n=24)

圖1 兩組角膜HE染色(×400)

表4 兩組干預(yù)后角膜HE染色及電鏡結(jié)果對(duì)比

2.5TEM結(jié)果 A組上皮細(xì)胞界限分明，明亮細(xì)胞較多，微絨毛和褶皺排列整齊，未見(jiàn)明顯異常；B組上皮細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)異常，大小均勻等，邊界較清晰，微絨毛和褶皺排列整齊，微絨毛數(shù)量減少，但與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4、圖2。

圖2 兩組角膜TEM圖像(×10 000)

3 討 論

LED因其低耗能、照明強(qiáng)而在市場(chǎng)上占據(jù)越來(lái)越大的地位，而對(duì)眼睛造成的損傷不容忽視〔8〕，會(huì)導(dǎo)致近視、白內(nèi)障等眼部疾病〔9〕。同時(shí)也有研究表明強(qiáng)光、激光照射會(huì)促進(jìn)脈絡(luò)膜新生血管形成，損傷視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與功能〔10～12〕。LED包含紅、藍(lán)、綠3種不同波長(zhǎng)的光，其中藍(lán)光波長(zhǎng)介于380～500 nm之間，而角膜僅能吸收295 nm以下的可見(jiàn)光〔13〕，故藍(lán)光可能會(huì)對(duì)角膜造成損傷。大氣中的紫外線為不可見(jiàn)光，波長(zhǎng)小于400 nm，當(dāng)眼球過(guò)度吸收紫外線時(shí)，發(fā)現(xiàn)患白內(nèi)障的概率大大增加〔14〕。當(dāng)然，并不是所有的藍(lán)光都對(duì)人體有害，藍(lán)光中存在低能量部分是可以起到保護(hù)作用的〔15〕，可以刺激黑色素細(xì)胞而調(diào)節(jié)人體的晝夜規(guī)律〔16〕，但藍(lán)光中的高能部分(波長(zhǎng)415～455 nm)同紫外線一樣，會(huì)對(duì)眼球造成損傷，致使視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，發(fā)生黃斑變性等〔17～20〕，而這些高能藍(lán)光主要存在于電子產(chǎn)品中，如智能手機(jī)、平板電腦等。氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在干眼癥發(fā)病中起關(guān)鍵作用〔21〕，而藍(lán)光具有促進(jìn)氧化應(yīng)激的作用〔22〕。研究表明，過(guò)度暴露于具有短波長(zhǎng)的藍(lán)光下可引起角膜氧化，增加角膜及淚膜中炎癥因子的表達(dá)，如白細(xì)胞介素(IL)-1β，IL-6，通過(guò)核因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，形成氧化應(yīng)激產(chǎn)物，導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞DNA損傷，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡、杯狀細(xì)胞減少及黏蛋白表達(dá)紊亂，繼而造成淚膜損傷導(dǎo)致干眼癥〔23〕。

本研究使用小鼠為研究對(duì)象是因?yàn)槠溲郾砗腿讼嗨?，角膜上皮?xì)胞均由外胚層發(fā)育而來(lái)，將角膜分層，使之處于非角化狀態(tài)〔24〕。眼表的腺體分泌受中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控，當(dāng)淚膜損傷，眼表的光滑度則變差，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用會(huì)隨之下降〔25〕，因此，保護(hù)淚膜的穩(wěn)定性顯得尤為重要。淚膜從外到內(nèi)分別為脂質(zhì)層、水液層、黏蛋白層，厚度約3 μm，很容易發(fā)生損傷。淚膜的主要功能是維持眼表水分穩(wěn)定〔26〕，對(duì)獲取清晰視力起到了不可或缺的作用，當(dāng)眼表水分丟失時(shí)，淚膜功能受損，導(dǎo)致眼部出現(xiàn)的各種不適癥狀稱(chēng)為干眼綜合征〔27〕。主要表現(xiàn)為眼部不適、異物感、視疲勞、視物模糊等癥狀〔28,29〕。因此，有效地保護(hù)淚膜對(duì)降低干眼癥的發(fā)病率起到了重要作用。導(dǎo)致干眼的因素有很多，如吸煙、維生素缺乏和性激素失調(diào)等〔30～32〕。本實(shí)驗(yàn)可能時(shí)間較短，尚未累及到角膜上皮細(xì)胞，同時(shí)，沒(méi)有設(shè)置不同的光照梯度，分組較少，對(duì)比不夠強(qiáng)烈。當(dāng)然，藍(lán)光的功率也需要進(jìn)一步探索。因此認(rèn)為，短期藍(lán)光照射會(huì)影響老年小鼠淚膜功能的穩(wěn)定性，而對(duì)角膜上皮組織未造成損傷。本實(shí)驗(yàn)顯示藍(lán)光對(duì)淚膜的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，而干預(yù)后7 d HE染色與正常對(duì)照組結(jié)果無(wú)明顯差異，透射電鏡未見(jiàn)明顯異常，推測(cè)可能實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，尚未累及到角膜上皮細(xì)胞。

綜上，高能藍(lán)光照射會(huì)影響老年小鼠淚膜的穩(wěn)定性。但由于本實(shí)驗(yàn)藍(lán)光照射的時(shí)間較短，對(duì)角膜上皮的影響無(wú)法進(jìn)行較好的觀察。而且研究并未對(duì)藍(lán)光的能量設(shè)置較好的梯度，也就無(wú)法判斷各個(gè)能量梯度的藍(lán)光對(duì)淚膜的穩(wěn)定性及角膜上皮的影響程度。今后可進(jìn)一步加長(zhǎng)藍(lán)光照射的時(shí)間及設(shè)置不同的照射強(qiáng)度。另外，藍(lán)光損傷眼表與結(jié)膜杯狀細(xì)胞的黏蛋白分泌、眼瞼腺體(如瞼板腺和淚腺)形態(tài)變化而導(dǎo)致的淚膜黏蛋白層和脂質(zhì)層成分改變等是否有一定的關(guān)聯(lián)也需進(jìn)一步研究。值得探究的是，藍(lán)光照射是否是一個(gè)可逆的過(guò)程，去除藍(lán)光暴露的條件，老年小鼠的淚膜是否可以有所恢復(fù)甚至恢復(fù)正常，有待進(jìn)一步研究。