魚腥草芩藍(lán)口服液質(zhì)量控制方法研究

邢玉娟，王建國，劉升，李靈娟，劉運鎮(zhèn)，邱樹磊

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.山東省威海市環(huán)翠區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，山東威海 264200；3.河南牧翔動物藥業(yè)有限公司，鄭州 451162)

魚腥草芩藍(lán)口服液由魚腥草、黃芩、金銀花、連翹、板藍(lán)根組成，具有清熱解毒功效，臨床上常用于治療外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咽喉疼痛、急性咽炎、扁桃腺炎等癥[1]。試驗表明其具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[2]，近年來，將其開發(fā)成新獸藥[3]，用于治療雞感冒發(fā)熱，對于雞因外邪入侵引起的體溫升高、呼吸道感染等癥狀有明顯的改善作用，且應(yīng)用安全[4]，具有很好的市場前景。研究采用TLC法對魚腥草芩藍(lán)口服液中的魚腥草、黃芩、連翹和金銀花進(jìn)行鑒別，采用HPLC法測定黃芩苷和綠原酸的含量，為全面控制該制劑的質(zhì)量提供了準(zhǔn)確可靠的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies-1260型高效液相色譜儀，紫外可變波長檢測器，安捷倫色譜數(shù)據(jù)工作站；薄層色譜數(shù)碼相機成像系統(tǒng)，GoodSee-20E，上?？普苌萍加邢薰?；酸度計，PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試藥 魚腥草芩藍(lán)口服液，由河南牧翔動物藥業(yè)有限公司提供，批號：20160801、20160802、20160803。魚腥草對照藥材，批號121046-200403；連翹苷對照品，批號110821-201213；綠原酸對照品，批號110753-201314；黃芩苷對照品，批號110715-201318；以上均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G板、聚酰胺薄膜；雙蒸餾水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 魚腥草 取本品20 mL，用5%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至11-12，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取魚腥草對照藥材2 g，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗[5]，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮(15∶1)為展開劑，展開，取出，晾干 ，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果見圖1，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.1.2 黃芩 取本品5 mL，加乙醇10 mL，搖勻，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[5]，吸取上述兩種溶液5 μL，分別點于同一以4%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。結(jié)果見圖2，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.3 連翹 取本品10 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，6 g，內(nèi)徑1 cm)上，用70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[5]，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果見圖3，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.4 金銀花 取本品2 mL，加水20 mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[5]，吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果見圖4，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

S:魚腥草對照藥材；Y:陰性對照；1-3:魚腥草芩藍(lán)口服液S: the control of Houttuynia cordata; Y: negative control;1-3: Yuxingcao Qinlan oral liquid圖1 魚腥草TLC圖Fig 1 TLC diagram of Houttuynia cordata

S:黃芩苷對照品；Y:陰性對照；1-3:魚腥草芩藍(lán)口服液S: baicalin control; Y: negative control;1-3: Yuxingcao Qinlan oral liquid圖2 黃芩TLC圖Fig 2 TLC map of Scutellaria baicalensis

S:連翹苷對照品;Y:陰性對照:1-3:魚腥草芩藍(lán)口服液S: Fructus forsythoside control; Y: negative control;1～3: Yuxingcao Qinlan baicalen oral liquid圖3 連翹TLC圖Fig 3 TLC diagram of fructus forsythiae

S:綠原酸對照品;Y:陰性對照;1-3:魚腥草芩藍(lán)口服液S: Chlorogenic acid as a control product; Y: negative control;1-3: Yuxingcao Qinlan oral liquid圖4 金銀花TLC圖Fig 4 TLC diagram of honeysuckle

2.2 黃芩苷含量測定[6-7]

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填沖劑；以甲醇-0.6%磷酸溶液(47∶53)為流動相；檢測波長為278 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于2000。采用此色譜條件，流出的曲線基線穩(wěn)定、分離度高，重復(fù)性好，因此本品采用此色譜條件進(jìn)行含量測定。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定28.31 mg(含量為93.3%)，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品2 mL，置250 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗 依據(jù)處方中的比例，按制法制備缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液，在選定的色譜條件下，同時取對照品溶液、供試品溶液、缺黃芩的陰性對照溶液進(jìn)樣。結(jié)果供試品溶液色譜中與對照品溶液在相同的保留時間內(nèi)有相似的黃芩苷色譜峰，而陰性對照溶液無此峰，說明魚腥草芩藍(lán)口服液的其它成分對黃芩苷的測定無干擾(圖5A-C)。

A 黃芩苷對照品HPLC圖 HPLC diagram of baicalin controlB 供試品HPLC圖 Test product HPLC diagramC缺黃芩陰性樣品HPLC圖 HPLC map of negative scutellaria圖5 魚腥草芩藍(lán)口服液中黃芩苷的HPLC圖Fig 5 HPLC diagram of Baicalin in Yuxingcao Qinlan oral liquid

2.2.5 線性關(guān)系試驗 精密量取對照品貯備溶液適量，用甲醇稀釋制成濃度為含黃芩苷分別為10.57、26.41、52.83、105.65、132.06、264.13 μg/mL的系列對照品溶液，搖勻，在選定的色譜條件下，進(jìn)樣10 μL，記錄各色譜峰峰面積；以進(jìn)樣濃度(X，μg/mL)與峰面積均值(Y，mAu)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芩苷回歸方程Y=33.42325X-214.6128，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.1057～2.6413 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 取同一濃度的黃芩苷對照品溶液，在選定色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄黃芩苷峰面積，平均峰面積為1862.17，其RSD為0.87%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批供試品(批號：20160802)，按供試品溶液制備方法，制備6份樣品，在選定的色譜條件下，測定峰面積并計算含量。結(jié)果黃芩苷平均含量為6.03 mg/mL，RSD為0.15%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品(批號：20160801)，按照供試品溶液制備方法配制溶液，在選定的色譜條件下，分別于0、2、4、8、12 h測定，測定峰面積并計算含量。結(jié)果黃芩苷平均含量為6.22 mg/mL，RSD為0.09%，表明供試品溶液中黃芩苷在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取黃芩苷對照品(含量為93.3%)65.59 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度備用。精密量取已知含量(6.22 mg/mL)的魚腥草芩藍(lán)口服液(批號為：20160801)1 mL，置250 mL量瓶中，精密加入上述對照品溶液10 mL，加甲醇適量，超聲處理20 min，放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按上述方法，制備供試品溶液6份，在選定色譜條件下，測定黃芩苷含量并計算回收率。結(jié)果黃芩苷的加樣回收率在98.03%～99.67%，平均值為98.74%，RSD為0.70%，表明回收率良好。

2.2.10 黃芩苷含量限度測定 取連續(xù)批次生產(chǎn)的魚腥草芩藍(lán)口服液10批，按供試品溶液制備方法處理，取10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果黃芩苷平均含量為6.32 mg/mL，根據(jù)產(chǎn)品測定結(jié)果，結(jié)合加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果，暫定本品中每1 mL含黃芩按黃芩苷(C21H18O11)計，不得少于4.50 mg。

2.3 綠原酸含量測定[8-10]

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)為流動相，檢測波長324 nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于3000。采用此色譜條件，流出的曲線基線穩(wěn)定、分離度高，重復(fù)性好，因此本品采用此色譜條件進(jìn)行含量測定。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取本品10 mL，置100 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加水制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.3.4 缺金銀花陰性對照溶液的制備 依據(jù)處方中的比例，按制法制備缺金銀花陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.3.5 綠原酸專屬性試驗 在選定的色譜條件下，同時取對照品溶液、供試品溶液、上述陰性樣品溶液，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，供試品溶液主峰的保留時間與綠原酸對照品溶液主峰的保留時間一致，缺金銀花的陰性樣品溶液略有干擾；缺金銀花和連翹的陰性樣品溶液略有干擾；但是缺金銀花和魚腥草的陰性樣品溶液無干擾；缺魚腥草金銀花連翹陰性樣品溶液無干擾(圖6D-H)。

D綠原酸對照品HPLC圖 HPLC diagram of chlorogenic acid as a control productE供試品HPLC圖 Test product HPLC diagramF缺金銀花陰性HPLC圖 Negative HPLC diagram of honeysuckleG缺金銀花和連翹陰性HPLC圖 Negative HPLC diagram of honeysuckle and forsythia forsythiaH缺金銀花和魚腥草陰性HPLC圖 Negative HPLC diagram of honeysuckle and houttuyniaI缺金銀花、魚腥草和連翹HPLC圖 HPLC map of honeysuckle, houttuynia cordata and forsythia forsythia圖6 魚腥草芩藍(lán)口服液中綠原酸的HPLC圖Fig 6 HPLC diagram of chlorogenic in Yuxingcao Qinlan oral liquid

由試驗可知，處方中的綠原酸歸屬為金銀花約占(802.5-43.5)/802.5=94.6%，魚腥草占(43.5-39.7)/802.5=4.7%，連翹所占綠原酸含量極低忽略不計。綠原酸的歸屬為金銀花和魚腥草(表1)。

2.3.6 綠原酸線性關(guān)系試驗 精密量取綠原酸對照品儲備液適量，用水稀釋成濃度為綠原酸分別為4.10、8.20、16.41、41.02、82.04、205.10 μg/mL，搖勻。在選定的色譜條件下，進(jìn)樣10 μL，記錄各色譜峰峰面積；峰面積為縱坐標(biāo)，以峰面積(Y，mAu)對濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸回歸方程為：Y=-86.78088+27.5937X，相關(guān)系數(shù)r=0.9995，回歸顯著。結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣量在0.041～2.051 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

表1 專屬性色譜圖信息Tab 1 Specific chromatographic information

2.3.7 綠原酸精密度試驗 取同一濃度綠原酸對照品溶液，在選定的色譜條件下，進(jìn)樣量10 μL，分別平行進(jìn)樣6次，記錄綠原酸峰面積，平均峰面積為934.5438，RSD為0.4%，表明所用儀器精密度良好。

2.3.8 綠原酸重復(fù)性試驗 取同一批供試品(批號：20160905)，按供試品溶液制備方法，制備6份樣品，在選定的色譜條件下，進(jìn)樣量10 μL，測定峰面積并計算含量。結(jié)果綠原酸平均含量為0.4 mg/mL，RSD為1.3%，表明重復(fù)性良好。

2.3.9 綠原酸日間穩(wěn)定性試驗 取供試品(批號：20160905)，按供試品溶液制備方法，在選定的色譜條件下，進(jìn)樣量10 μL，分別在0、2、4、6、8 h測定，結(jié)果平均含量為0.4 mg/mL，RSD為1.8%，制備的供試品溶液中綠原酸在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.10 綠原酸加樣回收率試驗 魚腥草芩藍(lán)口服液批號為20160905，綠原酸含量為0.41 mg/mL，精密量取供試品5 mL，置100 mL量瓶中，加水適量，加入綠原酸對照品(含量為96.2%)，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按上述方法，制備供試品溶液6份，在選定的色譜條件下，測定綠原酸含量并計算回收率。結(jié)果綠原酸的加樣回收率在98.41%～99.45%，平均值為99.08%，RSD為0.42%，表明回收率良好。

2.3.11 綠原酸含量限度測定 取連續(xù)批次生產(chǎn)的魚腥草芩藍(lán)口服液10批，按供試品溶液制備方法處理，取10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果綠原酸平均含量為0.41 mg/mL，根據(jù)產(chǎn)品測定結(jié)果，結(jié)合加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果，每1 mL含金銀花、魚腥草以綠原酸(C16H18O9)計，不得少于0.20 mg。

3 討論與結(jié)論

3.1 TLC鑒別方法的選擇 研究采用TLC法對魚腥草芩藍(lán)口服液中的魚腥草、黃芩、連翹和金銀花進(jìn)行了定性分析，通過方法篩選結(jié)果[5，11-12]，釆用該鑒別方法簡單易行，具有分離度好、重復(fù)性好、專屬性強的特點，能清晰的看到魚腥草、黃芩、連翹和金銀花的特征性顯色斑點，專屬性較強，陰性無干擾。

3.2 HPLC定量檢測時色譜條件的選擇 研究對檢測波長進(jìn)行了比較。通過全波長掃描顯示，黃芩苷在315和278 nm都有波峰吸收，但在278 nm處具有最大吸收，故選擇278 nm為黃芩苷的檢測波長；綠原酸在217和324 nm都有波峰吸收，但在324 nm處最大吸收，故選擇324 nm為綠原酸的檢測波長[13]。

在流動相的選擇上，黃芩苷實驗中考察了甲醇-水(1∶1)、甲醇-0.6%磷酸溶液(47∶53)為流動相，結(jié)果顯示前者黃芩苷色譜峰峰型不符合測定要求，故選甲醇-0.6%磷酸溶液(47∶53)作為流動相[14]；綠原酸實驗中考察了甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)為流動相，采用此色譜條件，流出的曲線基線穩(wěn)定、分離度高，重復(fù)性好，因此本品采用此色譜條件進(jìn)行含量測定。

3.3 超聲提取時間的考察 為了最大限度的提取藥液中的有效成分，本研究對超聲時間進(jìn)行了考察。黃芩苷供試品不超聲和超聲10、20、30 min，黃芩苷含量分別為5.89、5.90、6.06、6.06 mg/mL，超聲20 min即可提取充分；綠原酸供試品在不超聲和超聲10、20、30 min，綠原酸含量標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%，含量差別不明顯[15]。

3.4 綠原酸的歸屬考察 試驗表明，供試品溶液主峰的保留時間與綠原酸對照品溶液主峰的保留時間一致，缺金銀花陰性溶液的綠原酸峰面積占供試品溶液綠原酸峰面積為5.4%；缺金銀花和連翹陰性溶液的綠原酸峰面積占供試品溶液綠原酸峰面積為4.7%；缺金銀花和魚腥草陰性溶液的綠原酸峰極小未積分；缺魚腥草、金銀花和連翹陰性溶液在綠原酸對照品色譜峰的保留時間處，無干擾，專屬性強，不影響產(chǎn)品質(zhì)量控制，方法學(xué)符合要求。由試驗可知，處方中的綠原酸歸屬為金銀花約占94.6%，魚腥草約占4.7%，連翹所占綠原酸含量極低忽略不計。綠原酸的歸屬為金銀花和魚腥草，這和陸安等人的研究結(jié)果一致[16-18]。

魚腥草芩藍(lán)口服液的成分復(fù)雜，為了在生產(chǎn)中能保證藥品質(zhì)量，研究選擇用薄層色譜法對魚腥草、黃芩、連翹和金銀花進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法測定魚腥草芩藍(lán)口服液中黃芩苷和綠原酸的含量，暫定本品中每1 mL含黃芩按黃芩苷(C21H18O11)計，不得少于4.50 mg；每1 mL含金銀花、魚腥草以綠原酸(C16H18O9)計，不得少于0.20 mg。