消石通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

崔恩忠，唐安福，貢 磊，湯

（中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002）

消石通顆粒為我院院內(nèi)制劑，由金錢草、冬瓜皮、徐長(zhǎng)卿、海金沙、車前子、雞內(nèi)金、石韋、白茅根、瞿麥蓄和甘草共11味中藥組方，具有清熱解毒、利尿通淋的功效，主治石淋，用于尿路結(jié)石、尿路感染等，處方復(fù)雜，所含藥味種類繁多，成分復(fù)雜。因此本試驗(yàn)中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)方中金錢草、雞內(nèi)金和甘草3味藥進(jìn)行鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)制劑中所含綠原酸總量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1-3]，從而更好地控制其質(zhì)量[4-5]。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters1525型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；FA1104型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；調(diào)溫電熱器（南通通州申通電熱器廠）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

試藥：對(duì)照藥材金錢草（批號(hào)為120923-201113），雞內(nèi)金（批號(hào)為121072-201109），甘草（批號(hào)為110756-200110），對(duì)照品綠原酸（批號(hào)為110753-200413），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；消石通顆粒（醫(yī) 院 自 制，批 號(hào) 分 別 為150316，150504，151213，160627，161115）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 薄層色譜鑒別

金錢草：取樣品，研細(xì)，稱取40 g，加100 mL乙醇回流2h，過(guò)濾，取濾液，蒸干，加30mL水溶解，分別用10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸干后加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取金錢草對(duì)照藥材1 g，粉碎，加50 mL水煎煮3次，每次1 h，合并煎液并濃縮至30 mL，過(guò)濾，取濾液，蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用乙酸乙酯萃取，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。再按處方比例稱取缺金錢草的處方藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法試驗(yàn)[1]，分別吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液與陰性對(duì)照品溶液10，20，20μL進(jìn)樣，展開(kāi)劑為甲苯-二氯甲烷-丙酮-甲醇（35∶25∶30∶10，V∶V∶V∶V），展開(kāi)，取出，晾干，并噴5%磷鉬酸乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1 A）。

圖1 薄層色譜圖

圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

雞內(nèi)金：取本品，研細(xì)，稱取40 g，加100 mL乙醇回流1 h，過(guò)濾，取濾液，蒸干，加30 mL水溶解，醇沉后靜置2 h，過(guò)濾，取濾液，將乙醇蒸干，加30 mL水與1 mL鹽酸，加熱回流1 h，放冷，用15 mL正丁醇萃取3次，合并萃取液，蒸干，加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取雞內(nèi)金對(duì)照藥材1 g，粉碎，加50 mL水與1 mL鹽酸，煎煮3次，每次1 h，合并煎液并濃縮至30 mL，醇沉，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。再按處方比例稱取缺雞內(nèi)金的處方藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法試驗(yàn)[1]，吸取上述3種溶液各20μL進(jìn)樣，展開(kāi)劑為正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5，V∶V∶V）的上層溶液，展開(kāi)，取出，晾干，并噴0．2%茚三酮乙醇溶液，105℃烘約5 min至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1 B）。

甘草：取本品，研細(xì)，稱取30 g，加50 mL甲醇超聲30 min，過(guò)濾，取濾渣，揮干，加適量水溶解，用20 mL乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取甘草對(duì)照藥材0．25 g，粉碎，加20 mL乙醚超聲30 min，棄去乙醚液，濾渣揮干，加20 mL甲醇超聲30 min，過(guò)濾，殘?jiān)舾珊蠹蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再按處方比例稱取缺甘草的處方藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法試驗(yàn)[1]，吸取上述3種溶液各4μL進(jìn)樣，展開(kāi)劑為正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5，V∶V∶V）的上層溶液，展開(kāi)，取出，晾干，并噴0．2%茚三酮乙醇溶液，105℃烘約5 min至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1 C）。

2．2 綠原酸含量測(cè)定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0．4%冰醋酸溶液（20∶80，V∶V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：35℃；流速：1．0 mL／min；進(jìn)樣量：10μL。

2．2．2 溶液制備

取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量，制成每1 mL含35．6μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取樣品10 g，精密稱定，置100 mL燒杯中，加約90 mL沸水，攪拌溶解，放冷后離心5 min（5 000 r／min），取上清液，加水定容至100 mL，攪勻，即得供試品溶液。按比例稱取處方藥材飲片（除金錢草、石韋、蓄、白茅根、車前子外），根據(jù)制劑工藝制備消石通顆粒陰性樣品，依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2．2．2項(xiàng)下3種溶液各10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有同一色譜峰，而陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品溶液8，6，5，4，2 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成 質(zhì) 量 濃 度 為35．6，28．48，21．36，17．14，14．24，7．12μg／mL的系列對(duì)照品溶液，各吸取10μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=29 121X＋25 142，r=0．999 2（n=6）。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在7．12～35．60μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，精密吸取10μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄綠原酸峰面積。結(jié)果的RSD為0．69%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為150316）適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，在常溫下分別于0，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0．80%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為150316）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果的RSD為2．13%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取綠原酸對(duì)照品17．80 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得178μg／mL的對(duì)照品貯備液。取已知含量的樣品（批號(hào)為150316，綠原酸含量為0．145 mg／g），研細(xì)，取粉末9份各5．00 g，平均分成3組，分別精密加入對(duì)照品貯備液3．30，4．00，5．00 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2．2．4 樣品含量測(cè)定取3批樣品（批號(hào)分別為151213，160627，161115），依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果含量分別為0．081，0．129，0．169 mg／g。

3 討論

薄層鑒別項(xiàng)選擇：經(jīng)查閱文獻(xiàn)并經(jīng)試驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn)，2015年版《中國(guó)藥典（一部）》暫未收載處方中冬瓜皮、石韋的薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)[6]，海金沙、瞿麥、蓄、白茅根均有陰性干擾，故最終篩選金錢草、雞內(nèi)金及甘草作為薄層鑒別項(xiàng)。

含量測(cè)定指標(biāo)選擇：2015年版《中國(guó)藥典（一部）》暫未收載處方中海金沙、雞內(nèi)金、瞿麥、白茅根、冬瓜皮5味藥材含量測(cè)定項(xiàng)；而車前子、徐長(zhǎng)卿和甘草中所含京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草酸和甘草苷等化學(xué)成分[7-9]的含量太低；此外，金錢草、石韋和蓄等藥中均含有槲皮素、山柰酚和綠原酸等成分，但因該制劑制備工藝中所有藥材均為水提取，導(dǎo)致成品中這3種成分含量并不高。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，綠原酸為眾多藥材和中成藥抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，同時(shí)也是質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[10-12]。鑒于綠原酸在制劑臨床療效中發(fā)揮重要作用，且根據(jù)課題審評(píng)會(huì)專家意見(jiàn)，最終選擇綠原酸總量作為制劑質(zhì)量控制指標(biāo)。

色譜條件選擇：參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》金銀花藥材中綠原酸的含量測(cè)定方法，選擇最大吸收波長(zhǎng)為327 nm。根據(jù)文獻(xiàn)研究和試驗(yàn)考察，流動(dòng)相選擇甲醇-0．4%冰醋酸溶液（20∶80，V∶V）時(shí)，色譜峰有較好的分離度，且峰形良好，故確定文中流動(dòng)相。

提取溶劑用量選擇：考察了5倍、10倍、15倍水提取條件下綠原酸的提取率，結(jié)果10倍水提取時(shí)，樣品中總綠原酸已基本提取完全，故最終選擇10倍水提取。

綜上所述，本研究中建立的金錢草、雞內(nèi)金和甘草的TLC鑒別方法及總綠原酸的HPLC含量測(cè)定方法，穩(wěn)定、可靠，可用于消石通顆粒的質(zhì)量控制。