茯苓三萜類成分利水作用的虛擬篩選

倪文娟，俞松林，張莉華，劉福和，崔明超，陳少軍

（浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，是利水滲濕之要藥，臨床用于治療各種水腫，其化學(xué)成分主要有多糖和三萜類成分，茯苓多糖具有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能[1-2]，但利水滲濕的有效成分還有待進(jìn)一步研究。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一類對(duì)水具有高度選擇性的細(xì)胞膜通道蛋白，廣泛存在于各種機(jī)體組織中，對(duì)水的分泌吸收及組織內(nèi)外、細(xì)胞內(nèi)外水平衡具有重要作用[3-4]。中醫(yī)脾運(yùn)化水濕與水通道蛋白存在緊密聯(lián)系，在脾胃濕熱、寒濕困脾、脾虛濕困、胃陰不足等不同證型中AQPs基因表達(dá)有變化[5]。因此，推測(cè)AQPs可能也是茯苓利水健脾的靶蛋白。傳統(tǒng)藥理篩選方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)提供了新的手段，減少了尋找新藥的盲目性和偶然性。本研究中以AQPs為靶蛋白，利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選茯苓三萜類成分中具有利水活性的有效成分，并探討其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 受體結(jié)構(gòu)信息來(lái)源及處理

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備：靶蛋白結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB（http：／／www．rcsb．org／pdb／home／home．do）中 下 載。脾胃中主要存在AQP1，3，4，5亞型。因PDB庫(kù)中沒(méi)有AQP3亞型結(jié)構(gòu)，故本研究中以AQP1，4，5為研究對(duì)象，其對(duì)應(yīng)的PDB文件號(hào)分別為1IH5，3GD8，3D9S。獲取結(jié)構(gòu)后，依次對(duì)靶蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢驗(yàn)、預(yù)處理，確定配體結(jié)合口袋等準(zhǔn)備工作。

1．2 茯苓三萜類小分子化合物庫(kù)準(zhǔn)備

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從茯苓中分離鑒別出三萜類成分39個(gè)。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，其分類[6]見(jiàn)表1。采用ISIS-draw軟件繪制2D結(jié)構(gòu)圖，在線轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，建立配體三維結(jié)構(gòu)庫(kù)。并用虛擬篩選PyRx軟件的Open Babel模塊對(duì)庫(kù)中各個(gè)小分子進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，將其轉(zhuǎn)換成PyRx軟件認(rèn)可的pdbqt格式[6]。

1．3 虛擬篩選

茯苓三萜成分與靶蛋白的匹配情況采用PyRx軟件的autodock Vina模塊進(jìn)行虛擬篩選和分子對(duì)接，根據(jù)系統(tǒng)能量的大小打分[7]。

1．4 數(shù)據(jù)分析與作圖

采用分子模擬圖形界面軟件Discovery Studio Visualizer 3．5進(jìn)行對(duì)接結(jié)果分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 與AQP1的作用

39個(gè)茯苓三萜小分子配體與AQP1進(jìn)行分子對(duì)接后，去氫松香酸甲酯與之的對(duì)接能最低，為-5 kJ／mol。去氫松香酸甲酯為三環(huán)二萜類，由圖1可見(jiàn)，其范德華力在對(duì)接中起主導(dǎo)作用；同時(shí)，195位Arg殘基、180位His殘基與去氫松香酸甲酯上的苯環(huán)形成了鹽橋，這是離子π-π相互作用，苯環(huán)中心由于四極-四極作用帶

部分負(fù)電荷，His和Arg殘基電離后中心碳原子帶部分正電荷。195位Arg，76位Asn殘基與配體形成靜電作用力。

表1 茯苓中的三萜類化合物

圖1 AQP1與去氫松香酸甲酯分子對(duì)接效果圖

圖2 AQP4與去氫松香酸甲酯分子對(duì)接效果圖

圖3 AQP5與去氫松香酸甲酯分子對(duì)接效果圖

2．2 與AQP4的作用

39個(gè)茯苓三萜小分子配體與AQP4進(jìn)行分子對(duì)接后，去氫松香酸甲酯與之的對(duì)接能最低，為-5．5 kJ／mol。由圖2可見(jiàn)，靜電作用力在對(duì)接中起主導(dǎo)作用。同時(shí)，234位Trp殘基與去氫松香酸甲酯上的苯環(huán)形成了鹽橋。234位Trp殘基與配體形成靜電力相互作用。

2．3 與AQP5的作用

39個(gè)茯苓三萜小分子配體與AQP5進(jìn)行分子對(duì)接后，去氫松香酸甲酯與之的對(duì)接能最低，為-7．6 kJ／mol。由圖3可見(jiàn)，范德華力在對(duì)接中起主導(dǎo)作用。同時(shí)，27位Phe殘基、51位Leu殘基與去氫松香酸甲酯上的苯環(huán)形成了鹽橋。48位Ala殘基與配體形成靜電力相互作用。

3 討論

AQPs的正常表達(dá)可能是運(yùn)化水濕、津液輸布的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，AQPs失?？赡苁菨癫⌒纬傻闹匾颉ｊ惛碌萚8]報(bào)道，脾胃濕熱證患者AQP4基因表達(dá)顯著升高。濕阻中焦證AQP1在胃賁門黏膜下組織和胃體中間黏膜表達(dá)減少，AQP1在胃賁門和小腸中段黏膜表達(dá)增加[9]。韋蒿等[10]報(bào)道，試驗(yàn)性脾胃濕熱證模型大鼠胃黏膜AQP3和AQP4的表達(dá)明顯升高，推測(cè)AQP3和AQP4基因表達(dá)增強(qiáng)是機(jī)體對(duì)胃黏膜炎癥損害的保護(hù)性反應(yīng)。

茯苓等利水中藥對(duì)AQPs的調(diào)節(jié)也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。茯苓和豬苓均可引起正常大鼠尿量增加和尿滲量降低，并在用藥早期可降低尿液中AQP2的排泄[11]。江月斐等[12]報(bào)道，脾陽(yáng)虛泄瀉的大鼠胃體、回腸、結(jié)腸組織中AQP3表達(dá)減弱，提示脾主運(yùn)化水液功能減退，而用苓桂術(shù)甘湯治療可提高脾陽(yáng)虛大鼠胃腸道AQP3的表達(dá)。175 mmol／L NaCl高滲溶液可促使IMCD-3細(xì)胞AQP2蛋白表達(dá)升高，而茯苓可通過(guò)抑制PKA通量來(lái)降低高滲誘導(dǎo)AQP2表達(dá)，并具有抗凋亡作用[13]。

茯苓作為滲濕健脾的要藥，可作用于脾胃的AQPs蛋白，達(dá)到利水滲濕作用。在39個(gè)茯苓三萜成分中，去氫松香酸甲酯與AQP1，AQP4，AQP5對(duì)接的結(jié)合能較低，說(shuō)明其作用活性較好。水通道不同亞型AQP1，4，5都與去氫松香酸甲酯的活性是最強(qiáng)的，原因可能是：1）AQP1，4，5的基因結(jié)構(gòu)相似，相互氨基酸序列具有30%～50%的同源性，都屬AQP家族中的水選擇性通道亞家族[14-15]。2）去氫松香酸甲酯為三環(huán)二萜類，比其他38個(gè)茯苓三萜類都小。而AQPs為通道蛋白，通道有一定大小。去氫松香酸甲酯結(jié)構(gòu)相對(duì)較小，更易進(jìn)入通道內(nèi)部，也就更有利于與AQPs結(jié)合，這一點(diǎn)在圖2中得到了驗(yàn)證。去氫松香酸甲酯與AQP1，4，5對(duì)接的位點(diǎn)都不同。對(duì)于靶蛋白來(lái)說(shuō)，是存在不同的結(jié)合位點(diǎn)。以AQP4為例，本研究中AQP4的PDB文件號(hào)是3GD8，該蛋白結(jié)構(gòu)就存在6種不同的配體結(jié)合位點(diǎn)。

茯苓三萜類成分中氫松香酸甲酯與AQP1，4，5結(jié)合的活性較強(qiáng)。通過(guò)分析去氫松香酸甲酯與AQP1，4，5作用位點(diǎn)和作用力可進(jìn)一步了解茯苓利水滲濕機(jī)制，為臨床治療脾胃濕熱癥提供理論支持，并為后續(xù)活性成分研究和結(jié)構(gòu)修飾提供參考。