右美托咪定誘導(dǎo)家兔心動過緩竇房結(jié)縫隙連接基因蛋白Cx45和Cx31．9表達研究

田友芳，吳 江，宋 偉，胡 兵，姚猛飛△

（1．福建省漳州正興醫(yī)院第二手術(shù)室，福建 漳州 363000；2．中國人民解放軍第一七五醫(yī)院麻醉科，福建 漳州 363000）

心動過緩又稱心率過緩，是心律失常的一種類型。成人的正常心率是60～100次／分，而心率過緩是指心率低于60次／分，當(dāng)?shù)陀?5次／分時，常見臨床表現(xiàn)有頭暈、倦怠、乏力和精神不好等。目前，治療心動過緩如糾正可逆轉(zhuǎn)的原發(fā)病因及藥品不良反應(yīng)影響后，仍不可逆時，需植入心臟起搏器。右美托咪定是一種α2腎上腺素受體激動劑，具有中樞性抗交感作用，產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)靜作用，臨床常用于全身麻醉的手術(shù)患者氣管插管和機械通氣時的鎮(zhèn)靜；另外，對呼吸無抑制，能保護患者心、腎、腦等器官功能，具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用[1]。本研究中用右美托咪定注射3組健康家兔，通過實驗檢測竇房結(jié)縫隙連接基因蛋白Cx45和Cx31．9表達變化情況。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器

儀器型號和廠家詳見表1。

表1 儀器型號和廠家

1．2 動物與分組

8周齡健康家兔，36只，雌雄各半，體質(zhì)量2～3 kg，購于漳州正興醫(yī)院動物實驗中心，在動物中心無菌條件下飼養(yǎng)，本實驗由漳州正興醫(yī)院動物倫理委員會審核并通過。隨機分為3組，各12只。對照組（A組）持續(xù)注射生理鹽水15 mL／kg，作為空白對照；B組注射鹽酸右美托咪定注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20090248，規(guī)格為每支2 mL∶200μg）20μg／kg負(fù)荷量10 min，10μg／（kg·h）持續(xù)注射50 min；C組注射右美托咪定80μg／kg負(fù)荷量10 min，40μg／（kg·h）持續(xù)注射50 min。

1．3 方法

采用司可巴比妥鈉（北京益民藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H11020900，規(guī)格為每支50 g）30 mg／kg麻醉家兔后仰臥固定，四肢插入針灸電極監(jiān)測心電活動，排除心電圖（ECG）異常家兔，采用生物信號采集處理系統(tǒng)分別于右美托咪定注射前（T0），注射后15 min（T1）、30 min（T2）、60 min（T3）監(jiān)測心率（HR）和平均動脈壓（MAP）。當(dāng)B組和C組家兔的檢測指標(biāo)與A組出現(xiàn)顯著差異，即與正常心率相比，B組和C組心率下降30%視為建模成功，繼續(xù)進行后續(xù)實驗。實驗觀察結(jié)束后加深麻醉，迅速開胸，取出心臟置于有臺氏液（現(xiàn)配現(xiàn)用）的托盤內(nèi)，分離竇房結(jié)組織。每組6只提取總RNA和總蛋白，進行蛋白免疫印跡雜交（WB）、實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測Cx45和Cx31．9的mRNA表達水平；6只用甲醛固定，石蠟包埋，切片，進行免疫組化（IHC）染色，每只切片取3個視野，計算平均光密度，即為Cx45和Cx31．9蛋白表達水平。其中，RT-PCR的引物序列見表2。

表2 目的基因擴增引物序列

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22．0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料用X±s表示，行t檢驗；不同時點組內(nèi)比較采用重復(fù)測量的方差分析，同時點組間比較行單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 給藥過程中HR和MAP比較

T0時，3組組間HR和MAP比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），T1～T3時，B組、C組的HR和MAP顯著低于A組（P＜0．05）；C組的HR明顯慢于B組（P＜0．05）；B組、C組的MAP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。詳見表3。

表3 3組家兔給藥過程中HR和MAP比較（X±s，n=12）

2．2 RT-PCR驗證3組家兔竇房結(jié)組織Cx45和Cx31．9基因表達水平

Cx45 mRNA表達，A組＜B組＜C組，3組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；Cx31．9 mRNA表達水平，B組高于A組（P＜0．05），C組與B組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。詳見圖1。

圖1 3組家兔竇房結(jié)組織Cx45及Cx31．9 mRNA表達水平

2．3 IHC和WB驗證3組家兔竇房結(jié)組織Cx45和Cx31．9蛋白表達水平

Cx45蛋白表達，A組＜B組＜C組，3組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；Cx31．9蛋白表達水平，B組高于A組（P＜0．05），C組與B組無明顯差異（P＞0．05）；IHC和WB結(jié)果一致。詳見表4和圖2。

表4 3組家兔竇房結(jié)組織Cx45和Cx31．9蛋白表達水平比較（X±s，n=6）

圖2 WB驗證3組家兔Cx45和Cx31．9蛋白表達水平

3 討論

右美托咪定是一種無色透明液體，唯一同時具有鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用的麻醉藥物，能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，血管、腎臟等器官中廣泛存在的α2腎上腺素能受體結(jié)合，使用者進入非自然睡眠，產(chǎn)生催眠、抗焦慮作用[2-3]。右美托咪定能減輕使用者短暫性整體或局部腦缺血后的神經(jīng)損傷，具有保護神經(jīng)的作用[4]。家兔心動過緩模型建造成功的基本要求是家兔正常心率下降30%，而右美托咪定能有效抑制竇房結(jié)和房室結(jié)的相關(guān)功能，臨床麻醉和重癥監(jiān)護室中手術(shù)操作前或手術(shù)中鎮(zhèn)靜得到廣泛使用[5-7]。同時，臨床上使用右美托咪定后存在不良反應(yīng)，如誘發(fā)心動過緩，會導(dǎo)致心臟負(fù)性頻率和負(fù)性傳導(dǎo)，存在使心臟停搏的潛在危險[8-9]。

本研究結(jié)果表明，家兔注射右美托咪定后導(dǎo)致心動過緩，從而使心臟組織中的Cx45和Cx31．9基因表達發(fā)生變化，間接表明Cx45和Cx31．9表達發(fā)生變化是導(dǎo)致家兔心動過緩的原因之一。由此可見，以Cx45和Cx31．9基因表達為作用靶點，干擾其表達，能緩解甚至治療竇性心動過緩。但目前的研究結(jié)果表明，Cx45和Cx31．9基因表達與家兔竇性心動過緩有關(guān)，但其作用途徑與具體作用機制并不清楚。右美托咪定以何為靶點，通過何種途徑使Cx45和Cx31．9基因表達發(fā)生變化也需要進一步研究。由于Cx45和Cx31．9是2種低導(dǎo)電性的縫隙連接蛋白，在體內(nèi)的傳導(dǎo)方式相對較慢，從而使得新西蘭白兔竇性心動過緩。

綜上所述，基因Cx45和Cx31．9在給藥前后，即家兔心動過緩前后發(fā)生差異表達。右美托咪定具有直接興奮迷走神經(jīng)的作用，影響自主神經(jīng)的功能狀態(tài)，而基因表達能直接影響竇房結(jié)縫隙連接蛋白的表達水平[10]。探討基因Cx45和Cx31．9差異表達在家兔心動過緩中的作用，以及調(diào)控的分子機制，闡明其調(diào)控的分子信號通路，可為后期臨床上利用分子靶向治療心動過緩奠定基礎(chǔ)，探尋新思路。