乳癖消對(duì)曲妥珠單抗致大鼠心肌毒性的抑制作用研究*

董 林，曲芳菲，李永梅，于守君

（濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264100）

乳腺癌的生長(zhǎng)、侵犯、轉(zhuǎn)移與人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2（Her2）的表達(dá)密切相關(guān)。Her2過(guò)度表達(dá)的乳腺癌患者病情進(jìn)展迅速，化學(xué)治療及內(nèi)分泌治療的效果較差，預(yù)后不佳，總生存率偏低[1-2]。曲妥珠單抗（商品名赫賽?。┦且环N重組人源化單克隆抗體，可特異性地與Her2結(jié)合，抑制其促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，發(fā)揮靶向抗腫瘤作用，臨床主要用于治療組織學(xué)檢測(cè)Her2高表達(dá)的乳腺癌[3]。盡管曲妥珠單抗療效顯著，但患者常出現(xiàn)心功能不全的癥狀，主要表現(xiàn)為左心室收縮功能下降、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）降低[4]，血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳 酸 脫 氫 酶（LDH）、心 肌 肌 鈣 蛋 白I（cTnI）及N末端腦利鈉肽（NT-pro BNP）等心肌缺血或損傷的標(biāo)志物濃度顯著上升[5]，必須停止用藥。Her-2受體抑制劑可造成大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]?？赡芘c曲妥珠單抗引起的心肌毒性與線粒體凋亡通路有關(guān)。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，乳癖消具有軟堅(jiān)散結(jié)、活血消瘀、疏肝解郁功效，能降低血清中雌二醇與孕酮水平[7]，臨床主要用于治療乳腺增生、乳腺炎癥，現(xiàn)也作為乳腺癌抑制雌激素的輔助用藥。乳癖消中芍藥苷、三七皂苷、人參皂苷、連翹苷、哈巴俄苷、木犀草素、槲皮素等成分均能促進(jìn)血液循環(huán)、改善心肌能量代謝、清除自由基[8]。曲妥珠單抗聯(lián)用乳癖消治療乳腺癌，既可增強(qiáng)療效，又可降低心臟毒副作用。Her-2與大鼠相對(duì)應(yīng)的基因具有高度同源性[9]。本研究中擬通過(guò)大鼠尾靜脈注射曲妥珠單抗建立心肌損傷模型，探討乳癖消對(duì)該藥所致心肌毒性的抑制作用[10]，為優(yōu)化乳腺癌的治療方案提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)6周齡Wistar雌性大鼠50只，體質(zhì)量（199±8．5）g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（魯）20090001。

儀器：ACUSON SC2000型超聲顯像儀（Siemens公司）；ELx-808型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）；AU5800型全自動(dòng)生化分析儀（Beckman公司）；Elecsys2010型全自動(dòng)免疫分析儀（Roche公司）；Model 705型超聲勻漿器、Sorvall ST40型臺(tái)式離心機(jī)（Thermo Scientific公司）。

試藥：注射用曲妥珠單抗（商品名赫賽汀，上海羅氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20170037，規(guī)格為每瓶440 mg／20 mL）；乳癖消顆粒（哈爾濱泰華藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z19990028，規(guī)格為每袋8g）；CK-MB，LDH，cTnI，NT-pro BNP，MDA，SOD檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；Bcl-2，Bax含量測(cè)定試劑盒、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase）-9、Caspase-3活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Biovision公司；硫化鈉（Na2S）、水合氯醛溶液（上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司）。

1．2 方法

動(dòng)物分組與給藥：將50只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)組（高、中、低劑量組）和對(duì)照組，各10只。模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射曲妥珠單抗8 mg／kg；實(shí)驗(yàn)組注射曲妥珠單抗后按0．6，0．8，1．0 g／kg灌服乳癖消顆粒溶液；對(duì)照組注射相應(yīng)體積的曲妥珠單抗專(zhuān)用溶劑。連續(xù)給藥7 d后進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

溶液配制：注射用曲妥珠單抗用專(zhuān)屬溶劑溶解，配成質(zhì)量濃度為22 g／L的溶液，4℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)提前恢復(fù)至室溫。按各實(shí)驗(yàn)組大鼠服用劑量稱(chēng)取乳癖消顆粒，加入適量溫水沖配成溶液，每日1次給予灌胃。

1．3 觀察指標(biāo)

心功能：各組大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射每100 g體質(zhì)量0．3 mL水合氯醛，麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)上，用Na2S溶液脫去胸前雜毛，超聲顯像儀取胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面檢測(cè)各項(xiàng)心功能指標(biāo)[左心室后壁舒張期厚度（LVPWd）、左心室后壁收縮期厚度（LVPWs）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）]，計(jì) 算 左 心 室 射 血 分 數(shù)（LVEF，%）≈（LVEDd3-LVESd3）／LVEDd3×100%，短軸縮短率（LVFS，%）=（LVEDd-LVESd）／LVEDd×100%。

心肌損傷血清標(biāo)志物：固定好已麻醉的大鼠，清潔尾部污垢，用手術(shù)剪剪去尾尖2～3 mm，用手從尾根向下輕輕擠壓，將血液收集于離心管中至1．0 mL，靜置30 min后3 000 r／min離心，吸取500μL血清測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清CK-MB和LDH的濃度，用干式免疫熒光法試劑盒檢測(cè)cTnI和NT-pro BNP的水平。

線粒體凋亡途徑蛋白：將已麻醉的大鼠仰臥固定于解剖板上，去除胸前雜毛，沿劍突開(kāi)始剪開(kāi)胸骨，充分暴露胸腔，剪斷各條連通心臟的血管，迅速取出心臟，在4℃預(yù)冷冰袋的培養(yǎng)皿內(nèi)將心臟組織剪碎，稱(chēng)取約100 mg，在冰浴條件下以超聲勻漿器制成勻漿。在4℃條件下，3000r／min離心10min，吸取上清液，以微孔濾膜濾過(guò)，用BCA法蛋白定量試劑盒測(cè)定各個(gè)樣品的總蛋白含量，作為參考調(diào)整后續(xù)實(shí)驗(yàn)的上樣量。按照Bcl-2，Bax，Caspase-9，Caspase-3檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸法計(jì)算各種蛋白的含量或活性。

心肌氧化應(yīng)激水平：取上述心肌組織上清液，按MDA和SOD檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，按公式將吸光度值換算成MDA和SOD的含量。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 心功能超聲檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組大鼠的LVED和LVPW均有顯著變化（P＜0．05），LVEF和LVFS顯著降低（P＜0．05），表明其心功能已明顯受損。與模型組比較，低劑量組除左心室容積有所改善外，其余指標(biāo)未見(jiàn)好轉(zhuǎn)，而中、高劑量組可顯著抑制心肌組織的損傷變?。≒＜0．05），增加左心室舒張末期容積和減少收縮末期容積（P＜0．01），最終提高LVEF和LVFS（P＜0．05），大鼠的心功能狀況得到改善。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（X±s，n=10）

2．2 心肌損傷血清標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中CK-MB，LDH，cTnI，NT-proBNP等標(biāo)志物的濃度均顯著升高（P＜0．01），表明其心肌組織已出現(xiàn)較嚴(yán)重的損傷和壞死。與模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組隨著乳癖消劑量的增加，以上血清標(biāo)志物濃度逐漸降低（P＜0．05），其中高劑量組的下降幅度更顯著（P＜0．01），表明各實(shí)驗(yàn)組大鼠的心肌組織損傷狀況明顯得到緩解。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中CK-MB，LDH，cTnI，NT-pro BNP水平比較（X±s，n=10）

2．3 線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)，Bax的表達(dá)顯著加強(qiáng)（P＜0．01），Bcl-2與Bax的含量比值顯著減少（P＜0．05），致使Caspase-9和Caspase-3的活性增強(qiáng)（P＜0．01），從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組隨著乳癖消劑量的增加，Bax的表達(dá)與Caspase-9，Caspase-3的活性逐漸降低，Bcl-2的表達(dá)量和Bcl-2／Bax的比值逐漸增加（P＜0．05），表明乳癖消可通過(guò)逆轉(zhuǎn)Bcl-2和Bax的相對(duì)表達(dá)量而阻止Caspase-9及Caspase-3的激活，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2和Bax的表達(dá)量與Caspase-9和Caspase-3的活性比較（X±s，n=10）

2．4 MDA含量和SOD活性檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中的MDA含量顯著升高，而SOD的活性顯著下降（P＜0．01），表明該組大鼠的心肌組織已出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)受到氧化破壞。與模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組隨著乳癖消劑量的增加，MDA含量逐漸降低（P＜0．05），SOD的活性顯著增加（P＜0．05），其中高劑量組的作用最明顯（P＜0．01），表明乳癖消可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成的損傷。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠心肌組織中MDA的含量和SOD的活性比較（X±s，n=10）

3 討論

Her2屬跨膜受體型酪氨酸激酶，是Her2／neu原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色。因此，Her2一直作為乳腺癌靶向藥物的研究重點(diǎn)，目前上市的靶向藥物有曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等單抗藥物[11]，小分子靶向藥物拉帕替尼和阿法替尼，抗腫瘤效果理想，但隨著用藥時(shí)間和累積劑量的不斷增加，該類(lèi)藥物引發(fā)心臟毒副反應(yīng)的概率也逐漸上升，目前阿法替尼已因心肌毒性過(guò)高而在臨床上逐漸被減少使用[12]。Her2蛋白不僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，也表達(dá)于心肌組織和血管內(nèi)皮上，Her2相關(guān)信號(hào)通路具有穩(wěn)定心肌纖維結(jié)構(gòu)、降低氧化應(yīng)激損傷、促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)的作用。Her2靶向藥物發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)也抑制Her2通路對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，引起心臟血管損傷，妨礙血液供應(yīng)，導(dǎo)致心肌缺氧，引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。

本研究結(jié)果顯示，心臟超聲顯像檢測(cè)和血清學(xué)指標(biāo)表明，乳癖消可促進(jìn)大鼠心肌血管修復(fù)，改善血液循環(huán)，抑制心肌缺血壞死，進(jìn)而保護(hù)心肌纖維結(jié)構(gòu)，降低曲妥珠單抗所致心功能的衰退。凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)表明，乳癖消可通抑制線粒體凋亡途徑保護(hù)心肌細(xì)胞。在線粒體凋亡途徑中首要發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白是Bcl-2和Bax，兩者在線粒體外膜上含量的比例是決定細(xì)胞凋亡的重要因素[14]。Caspase是一類(lèi)與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，具有聯(lián)級(jí)傳遞和執(zhí)行凋亡反應(yīng)的作用，其中Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑（又稱(chēng)線粒體途徑）的專(zhuān)屬調(diào)控蛋白，受Bcl-2和Bax含量的比例調(diào)控；Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白，其活性受Caspase-9的調(diào)控，經(jīng)Caspase-9激活后的Caspase-3可促進(jìn)核內(nèi)DNA斷裂降解，最終使細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，乳癖消可通過(guò)上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)，提高Bcl-2／Bax的比例，從而抑制Caspase-9的活性，進(jìn)而阻止Caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序[16]。SOD的活性和MDA的含量是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的損傷指標(biāo)。當(dāng)心肌發(fā)生缺血損傷后，由于仍有血液經(jīng)側(cè)支血管供氧，導(dǎo)致胞內(nèi)氧自由基堆積，引起細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的氧化破壞，導(dǎo)致原處于缺氧狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)一步受損[17]。SOD和MDA的檢測(cè)結(jié)果表明，乳癖消能降低活性氧的含量，抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化，進(jìn)一步發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。

乳癖消由鹿角、蒲公英、昆布、天花粉、雞血藤、三七、赤芍、海藻、漏蘆、木香、玄參、丹皮、夏枯草、連翹、紅花15味中藥材組方，其中鹿角、三七、玄參、紅花、赤芍、木香等藥材具有改善心肌供氧，治療心力衰竭，降低再灌注損傷的作用。乳癖消中含有芍藥苷、三七皂苷、人參皂苷、連翹苷、哈巴俄苷、木犀草素、槲皮素等苷類(lèi)化合物，均有促進(jìn)血管修復(fù)生長(zhǎng)、改善線粒體能量代謝、促進(jìn)自由基清除等藥理活性，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[18]。本研究結(jié)果表明，乳癖消可有效降低曲妥珠單抗抑制Her2為受體通路所致心肌毒性，由此可推測(cè)其亦可降低其他Her2靶向藥物的心臟毒副作用。因此，在Her2陽(yáng)性的乳腺癌治療過(guò)程中，當(dāng)需要使用帕妥珠單抗、拉帕替尼或阿法替尼時(shí)，可考慮聯(lián)用乳癖消制劑作為降低心肌毒性的輔助用藥。