復(fù)方丹七郁膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其穩(wěn)定性研究*

譚本仁，鄭錦坤，徐曉梅，劉宴林，郭基燕

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512026；2．廣東省韶關(guān)市食品藥品檢驗所，廣東 韶關(guān) 512028）

復(fù)方丹七郁膠囊根據(jù)民間老中醫(yī)臨床多年應(yīng)用的驗方及傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論研制的中藥復(fù)方新制劑，以丹參、三七、郁金為主藥，配以川芎、澤瀉、石菖蒲、甘草等多種中藥組方，具有補肝腎、活血化瘀、調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化的功效。丹參有效成分主要有丹參酮、隱丹參酮、丹參酮ⅡA等脂溶性成分[1-2]，以及丹酚酸A，B，C，D，E和丹參素等水溶性成分，其中丹酚酸B含量最高，是丹參發(fā)揮療效作用的主要成分[3-5]。本研究中以薄層色譜（TLC）法對復(fù)方丹七郁膠囊中丹參主要成分丹參酮ⅡA和三七主要成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定復(fù)方丹七郁膠囊中丹酚酸B含量[6]，并全面考察其制劑穩(wěn)定性，為控制復(fù)方丹七郁膠囊的藥品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-2010C型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2450型紫外分光光度儀（日本島津公司）；HT-300BQ型數(shù)控超聲波清洗器（濟(jì)寧恒通超聲電子設(shè)備有限公司）。

1．2 試藥

三七皂苷R1對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號為110745-201318）；人參皂苷Rg1對照品（批號為110703-201530），人參皂苷Rb1對照品（批號為110704-201424）均由德思特生物有限公司提供；丹參酮ⅡA對照品（北京萬佳首化有限公司，批號為110766-201520）；丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111562-201313，純度為97．0%）；復(fù)方丹七郁膠囊（醫(yī)院制劑，批號分別為20150903，20150909，20150923）。硅膠G（供薄層層析用，青島海洋化工廠分廠）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 薄層色譜鑒別

丹參：取復(fù)方丹七郁膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱定，溶于70%甲醇10 mL，超聲處理0．5 h，濾過，作為供試品溶液；另取丹參酮ⅡA對照品適量，加乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度為1 g／L的對照品溶液。照TLC法，精密吸取供試品溶液、對照品溶液各4μL，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）為展開劑，1%香草醛硫酸溶液為顯色劑，在110℃加熱數(shù)分鐘。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯橙紅色斑點。詳見圖1。

三七：取三七藥材0．5 g，精密稱定，溶于甲醇5 mL，超聲處理15 min，取上清液作為三七對照藥材溶液；另取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 g／L的對照品溶液。照TLC法，精密吸取供試品溶液、三七對照藥材溶液、3種對照品溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-無水乙醇-水（70∶45∶6．5，V∶V∶V）為展開劑，硫酸乙醇溶液（1→10）為顯色劑，在110℃加熱數(shù)分鐘。供試品溶液色譜中，在與三七對照藥材溶液色譜和3種對照品溶液色譜相應(yīng)位置上，日光燈下檢視顯粉紅色斑點，紫外燈（365 nm）下檢視顯黃色斑點。詳見圖2。

2．2 含量測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；進(jìn)樣量：10μL；流動相：甲醇-乙腈-甲酸-水（10∶30∶1∶59，V∶V∶V∶V）；流速：1mL／min；柱溫：30℃；檢測波長：286 nm。

2．2．2 溶液制備

圖1 丹參薄層色譜圖

圖2 三七薄層色譜圖

取丹酚酸B對照品10．2 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，并超聲處理0．5 h，取出，放冷，并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0．2 g／L的對照品溶液。取復(fù)方丹七郁膠囊內(nèi)容物約1g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加70%甲醇適量，超聲0．5 h，取出，放冷，并稀釋至刻度，用0．45μm微孔濾膜濾過，即為供試品溶液。根據(jù)復(fù)方丹七郁膠囊處方比例制成缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取0．5，1．0，1．5，2．0，2．5 mL丹酚酸B對照品溶液分別置于10 mL容量瓶中，配制成系列對照品溶液，精密吸取各10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、丹酚酸B峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3 540．4X-2 360．2，r=0．999 2（n=5）。結(jié)果表明，丹酚酸B質(zhì)量濃度在9．94～49．71μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

專屬性試驗：精密吸取陰性對照溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果在與丹酚酸B對照品溶液出峰位置上無相應(yīng)色譜峰，表明陰性對照無干擾。色譜圖見圖3。

精密度試驗：取丹酚酸B對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測定含量。結(jié)果的RSD為0．05%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖3 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20150903）適量，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時各進(jìn)樣10μL。結(jié)果的RSD為0．75%（n=6），且未出現(xiàn)分層、失水等異?，F(xiàn)象，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為20150903）適量，平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣10μL。結(jié)果丹酚酸B的平均含量為1．75 mg／g，RSD為0．32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品溶液共6份，分別置10 mL容量瓶中，并精密加入適量的對照品溶液，加70%甲醇定容至刻度，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

2．3 穩(wěn)定性考察

加速試驗：取3批樣品，按2015年版《中國藥典》原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性指導(dǎo)原則，置溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%條件下貯藏，進(jìn)行6個月加速試驗，按2．2項下含量測定方法檢測，并考察外觀性狀，結(jié)果3批樣品外觀性狀無明顯變化，其丹酚酸B含量見表2。

表1 丹酚酸B加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

長期試驗：取3批樣品，按2015年版《中國藥典（二部）》原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性指導(dǎo)原則，置溫度（25±2）℃、相對濕度（60±10）%條件下貯藏，進(jìn)行12個月長期試驗，按2．2項下含量測定方法檢測，并考察外觀性狀。結(jié)果3批樣品外觀性狀無明顯變化，其丹酚酸B含量見表2。

表2 各批樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果（mg／g）

3 討論

復(fù)方丹七郁膠囊定性鑒別中，參考了2015年版《中國藥典（一部）》丹參和三七項下的TLC法[7]，因斑點分散，均對展開劑進(jìn)行了調(diào)整[8-9]，調(diào)整后，斑點圓整、清晰、無干擾，分離度好，易于鑒別。

現(xiàn)代藥理試驗表明，丹參可調(diào)血脂，尤其是降低血液中三酰甘油的作用明顯[10-11]。作為復(fù)方丹七郁膠囊的主藥，其主要活性物質(zhì)是丹酚酸B，故本研究中選擇其作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，通過參考文獻(xiàn)[12-14]，采用HPLC法測定復(fù)方丹七郁膠囊中丹酚酸B含量，結(jié)果顯示，以甲醇-乙腈-甲酸-水（10∶30∶1∶59，V∶V∶V∶V）為流動相，分離效果最佳，峰形對稱，陰性對照無干擾，能較好地測定其含量。通過復(fù)方丹七郁膠囊的穩(wěn)定性試驗，包括加速試驗和長期試驗，考察了其外觀性狀、含量等指標(biāo)，均無顯著變化，說明本品質(zhì)量穩(wěn)定。

綜上所述，所建立的復(fù)方丹七郁膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可為復(fù)方丹七郁膠囊的質(zhì)量控制提供參考。