動物藥羊膽水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉春花，熊丹丹，潘 潔，劉紹歡，李勇軍，王愛民，王永林，4△

（1．貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽 550004； 2．貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 3．貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 4．貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽550004）

膽汁作為一類重要動物藥[1]，除了熟知的熊膽、牛膽、蛇膽外，羊膽也是常用中藥。羊膽首載于陶弘景《本草經(jīng)集注》，《中藥大辭典》記載羊膽來源于?？粕窖?qū)賱游锷窖駽apra hircus Linnaeus、綿羊?qū)賱游锞d羊Ovis aries Linnaeus或山羚屬動物青羊Naemorhedus goralHardwicke的膽汁[2]?！哆|寧中藥志（動物、礦物、海洋類）》[3]《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）[4]中記載羊膽的來源是?？苿游锷窖駽apra hircusLinnaeus或綿羊OvisariesLinnaeus的膽汁。宰羊時，剖腹，割取膽囊，將膽管扎緊，懸通風(fēng)處晾干，或取新鮮膽汁入藥[2]。羊膽藥性苦寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清熱解毒、明目退翳、止咳等功效[2，5]，主治目赤腫痛、青盲夜盲、翳障、肺癆咳嗽、小兒熱驚、咽喉腫痛、黃疸、痢疾、便秘、熱毒瘡瘍等[2，4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羊膽有明顯的抗炎活性[5-7]，治療肺結(jié)核的療效確切[8]，具有良好的藥用價值。山羊或綿羊的膽汁主要含膽汁酸鹽、膽色素、黏蛋白、膽甾醇、卵磷脂、脂肪酸及碳酸氫鈉等[2，9]，動物膽汁中含量最高的物質(zhì)主要為膽酸和脫氧膽酸[10]。

目前，關(guān)于羊膽的質(zhì)量控制研究報道較少，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）[4]收錄了羊膽水，《福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2006年版）[11]收錄了羊膽膏，《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1993年版）[12]收錄了牛、羊膽汁，對羊膽的質(zhì)量控制項目較單一，均無含量測定項目，不能較好地控制羊膽的質(zhì)量。本研究中采用薄層色譜（TLC）法、總固體含量測定和高效液相色譜（HPLC）法進行研究，同時分析多批羊膽水樣品，為羊膽水的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

REPROSTAR3型薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士Camag公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；Prominence型高效液相色譜儀（日本島津企業(yè)管理＜中國＞有限公司）；EL204型電子天平（Mettler公司）；EL-204型電子天平（萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水機（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；KQ-300DE型超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1．2 試藥

羊膽粉對照藥材（批號為121524-201202），膽酸對照品（批號為100078-201415），均購于中國食品藥品檢定研究院；冰醋酸、三氯甲烷、異丙醇、甲醇、硫酸、磷鉬酸均為分析純，乙腈為色譜純，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，煙臺黃海江友硅膠開發(fā)有限公司，青島鼎康硅膠有限公司）；羊膽水10批，分別編號為S1（貴陽花溪）、S2（貴州習(xí)水）、S3（貴州鳳崗）、S4（貴州丹霞）、S5（貴州金沙）、S6（貴州習(xí)水）、S7（盤州板橋）、S8（貴州興義）、S9（貴州龍里）、S10（貴州貴陽），均在采收地宰殺現(xiàn)場收集，均來源于山羊，宰殺前均由貴州醫(yī)科大學(xué)中藥標(biāo)本館龍慶德副教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2．1 羊膽水TLC鑒別

分別量取10批羊膽水樣品各0．5 mL，置70℃水浴蒸干，殘渣加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取羊膽粉對照藥材10 mg，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材溶液。照TLC法（2015年版《中國藥典（四部）》通則0502）試驗，分別吸取不同批次供試品溶液與對照品溶液各1μL，分別點于同一硅膠G板，以異丙醇-三氯甲烷-冰醋酸-甲醇（30∶20∶4∶4，V∶V∶V∶V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴含3．5%磷鉬酸的20%硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖1。不同批次間可能各成分含量不同，因此對應(yīng)斑點顏色深淺存在差異。

2．2 總固體含量測定

取新鮮羊膽水，搖勻，精密量取10 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，置105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定質(zhì)量，計算供試品中新鮮膽汁干燥后所得質(zhì)量，結(jié)果見表1。10批羊膽水總固體含量范圍為0．046 1～0．076 0 g／mL，相差1．6倍。

2．3 羊膽水中膽酸含量測定

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

圖1 羊膽水薄層色譜圖

表1 各批羊膽水總固體含量（g／mL）

色譜柱：Phenomenex Luna-C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；柱溫：35℃；流動相：乙腈-0．1%磷酸溶液（45∶55）；流速：1 mL／min；檢測波長：192 nm；進樣量：5μL；柱溫：35℃。按擬訂色譜條件吸取對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在此條件下，膽酸與其他組分峰的分離度大于1．5，且空白無干擾，詳見圖2。

2．3．2 溶液制備

取膽酸對照品0．013 52 g，精密稱定，置2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為6．760 g／L的對照品溶液。再精密吸取上述溶液1 mL置5 mL容量瓶中，加10%甲醇定容，稀釋成質(zhì)量濃度為1．352 g／L的膽酸對照品溶液。

精密量取羊膽水5mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理15 min，放冷，用甲醇定容，過濾，精密吸取續(xù)濾液5mL，蒸干，加20%氫氧化鈉10 mL，回流2h，放冷，加稀鹽酸調(diào)pH至2～3，用乙酸乙酯萃取4次，每次15 mL，合并乙酸乙酯層溶液，蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2．3．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2．3．2項下對照品溶液（質(zhì)量濃度為6．760 g／L），用甲醇逐級稀釋至質(zhì)量濃度為3．3800，1．690 0，0．845 0，0．422 5 g／L。按擬訂色譜條件測定，以待測物的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得膽酸的回歸方程Y=10．448X＋1．011（r=0．9995）。結(jié)果表明，膽酸質(zhì)量濃度在0．4225～6．760 0 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為S5）樣品，分別精密吸取羊膽水樣品處理項下量（5 mL）的3個水平（50%，100%，150%）2．5，5．0，7．5 mL，各3份，共9份，依法制備供試品溶液，照擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算膽酸含量。結(jié)果膽酸平均含量為16．65 g／L，RSD為1．49%（n=9），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗：在與重復(fù)性不同的試驗時間（不同天），分別吸取羊膽水5 mL共3份，依法制備供試品溶液，照擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算膽酸含量。結(jié)果膽酸平均含量為16．67 g／L，RSD為0．34%（n=3），表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12 h時進樣分析。結(jié)果不同時間峰面積的RSD為1．97%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：精密量取與重復(fù)性試驗項下同批樣品2．5 mL，共9份，以重復(fù)性試驗結(jié)果（膽酸含量為16．65 g／L）計算羊膽水中膽酸的本底，分別按50%，100%，150%3個水平加入膽酸對照品，各3份，依法制備供試品溶液，進樣分析，計算回收率。結(jié)果見表2。

2．4 樣品含量測定

精密量取不同批次羊膽水5 mL，各2份，依法制備對照品溶液與供試品溶液，按擬訂色譜條件各進樣5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表3?？梢姡?批羊膽水藥材中膽酸含量在7．537～19．660 g／L。不同來源的羊膽水中膽酸含量差異較大，相差2．6倍，這可能與動物生長的環(huán)境存在一定關(guān)系。

圖2 高效液相色譜圖

表2 膽酸加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

表3 各批樣品中羊膽水含量測定結(jié)果（g／L）

3 討論

3．1 TLC條件選擇

曾對羊膽水的TLC鑒別方法進行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括不同的供試品制備方法的考察，直接利用不同試劑對羊膽水進行萃取和羊膽水揮干后用不同溶劑提取，最后發(fā)現(xiàn)直接揮干羊膽水后，加甲醇提取效果較好，同時還考察了甲醇的提取時間和溶劑體積等，得到最佳提取方法。通過對羊膽水TLC條件的優(yōu)化，包括不同展開系統(tǒng)和比例、不同視檢方法等，最終明確最佳色譜條件。最后考察了所建立TLC法的耐用性試驗，包括樣品溶液的穩(wěn)定性、不同廠家薄層板、不同展開環(huán)境溫度和相對濕度，最終發(fā)現(xiàn)耐用性良好，不同批次樣品與對照藥材分離結(jié)果良好。

3．2 HPLC法條件與方法選擇

羊膽水中含有多種化學(xué)成分，其中膽酸是其主要化學(xué)成分，占比最大[13-14]，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌、鎮(zhèn)靜等作用[15]，其可能是羊膽水中的主要活性成分，因此選擇膽酸作為指標(biāo)成分，建立HPLC含量測定方法。首先，考察了不同的樣品處理方法，包括不同超聲處理時間、氫氧化鈉用量和濃度、回流時間、萃取次數(shù)等，最終得到最佳提取條件。同時優(yōu)化了色譜條件參數(shù)，分別考察了最佳吸收波長、色譜柱、流動相比例和pH、流速、柱溫，得到最佳色譜條件。然后進行方法學(xué)驗證試驗，結(jié)果表明方法專屬性強，分離度良好，均符合要求，最終對10批樣品進行含量測定，發(fā)現(xiàn)來源不同使羊膽水樣品中膽酸含量存在較大差異，也可能與動物的生長年限、生長環(huán)境有關(guān)系，有待進一步研究。羊膽水屬液體藥物，因此測定了其總固體的含量，結(jié)果最大值與最小值相差1．6倍，這也可能是由動物的個體差異導(dǎo)致。

綜上所述，不同來源的羊膽水的總固體含量、膽酸含量均存在差異，造成差異的原因可能與羊的生活環(huán)境、食物、性別和羊自身的健康狀態(tài)及羊膽水收集的季節(jié)等因素有關(guān)。所用羊膽水均為山羊的膽汁，并未收集綿羊的膽汁，2種來源不同的羊膽水中膽酸含量是否存在差異，具體影響膽酸含量差異的因素需作進一步研究。