3個藏藥經(jīng)典方劑治療腦缺血有效物質(zhì)研究*

趙 騫，吳 瑩，譚 銳

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031）

腦缺血致死、致殘的重要原因是腦缺血造成的血管損傷和缺氧。藏藥在治療腦缺血方面的作用近年來逐漸被重視和發(fā)掘。謝彬等[1]報道，藏藥二十五味珍珠丸、如意珍寶丸、十五味沉香丸（簡稱“3個藏藥”）可顯著降低腦缺血模型大鼠腦梗死面積，對腦部組織產(chǎn)生保護作用。但藏藥藥味較多，組方復(fù)雜，“3個藏藥”共含有60余種藥材，其中主要含有化合物種類包括三萜酸類、酚酸類、黃酮類、生物堿類，還含有揮發(fā)油、氨基酸及礦物質(zhì)[2-4]。每味藥材都是1個小復(fù)方，如何從眾多主要成分中尋找針對不同藥效的有效成分，成了一個需要解決的問題。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種特異性的促有絲分裂原，又稱為促血管生成素、血管滲透因子，是影響血管發(fā)育的關(guān)鍵因子[5]，作為血管生成的調(diào)控者和血管滲透劑，與缺血后腦部循環(huán)系統(tǒng)的重建有關(guān)[6]。本研究中首先用含有VEGF啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，構(gòu)建了可用來篩選藥物對這VEGF基因作用效果的細胞模型，并驗證其有效性；然后用該細胞模型檢測“3個藏藥”中的17種主要成分，尋找哪些化合物可有效提高VEGF的轉(zhuǎn)錄水平，探討了“3個藏藥”治療腦缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)，從經(jīng)典驗方入手，為藏藥有效成分、藥理作用的研究了提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑和儀器

材料：人胚腎上皮細胞HEK-293株，含有VEGF基因啟動子的重組質(zhì)粒，均由四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)材料工程研究中心提供；“3個藏藥”所含有的17個化合物由西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院制備。

試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）、雙抗生素（100×penicillin-streptomycin）、Opti-MEM均由Gibco公司提供；磷酸緩沖液（PBS，成都哈里生物公司）；細胞培養(yǎng)板（Corning公司）；細胞培養(yǎng)皿（Thermo公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；G418（Amresco公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），細胞增殖-毒性檢測試劑盒（東仁化學(xué)＜上海＞公司）；熒光素酶檢測試劑盒（Promega公司）；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（Thermo公司）。

儀器：MACO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；SW-CJ-2N型超凈工作臺（哈爾濱東聯(lián)公司）；DSX-280A型滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Centrifuge 5424／5415R型 離 心 機（Eppendorf）；XW-80A型渦旋儀（上海青浦滬西儀器廠）；DMIL型顯微鏡、DMI 4000B型顯微鏡均由Leica公司提供；Varioskan?Flash酶標儀（Thermo Scientific）。

1．2 方法

HEK-293細胞培養(yǎng)條件：使用DMEM高糖培養(yǎng)基，按體積加入10%胎牛血清和1%雙抗生素，37℃，5%CO2，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每36～48 h傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞備用。

細胞模型的構(gòu)建和驗證：將對數(shù)生長期、長勢良好的HEK-293細胞接種到24孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達90%。使用熒光素酶活性分析系統(tǒng)，將含有VEGF啟動子和Luc報告基因的pVEGF promoter-Luc質(zhì)粒對HEK-293細胞進行轉(zhuǎn)染。使用陽性藥物脂多糖（存在于革蘭陰性菌細胞壁上，可啟動VEGF轉(zhuǎn)錄[7]）刺激轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK-293細胞（簡稱VEGF-293）和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK-293細胞，按Promega公司報告系統(tǒng)的標準操作方案檢測熒光素酶的活性，以驗證細胞模型的有效性。

待測化合物的處理：選取的17個化合物見表1?；衔锞褂肈MSO溶解為50 mmol／L的母液，于-20℃冰箱保存。根據(jù)需要，用DMSO稀釋成不同濃度的待測液，備用。

表1 17種待測化合物信息

細胞毒性檢測：每種化合物設(shè)置100，50，25，10μmol／L 4個濃度梯度。取對數(shù)生長期的VEGF-293細胞，以5×104的密度接種到96孔板中進行培養(yǎng)。24 h后，換成含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基處理細胞，設(shè)立DMSO（終體積0．1%）對照組和空白調(diào)零組，每組平行3個。培養(yǎng)24 h后，以CCK-8試劑盒檢測，酶標儀測定吸光度，計算細胞存活率。以細胞存活率90%以上為安全濃度。

相對存活率=（A加藥-A空白）／（A對照-A空白）×100%

熒光素酶分析：根據(jù)不同藥物的安全濃度，采用1．2．4項方法處理細胞24 h。設(shè)計DMSO（終體積0．1%）對照組，每組平行3個。分別使用熒光素酶檢測試劑盒檢測總熒光素酶活性，BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)總濃度。計算單位熒光素酶活性，并和對照組比較，得相對單位熒光素酶活性。

相對單位熒光素酶活性=（實驗組熒光素酶活性／實驗組蛋白質(zhì)濃度）／（對照組熒光素酶活性／對照組蛋白質(zhì)濃度）×100%。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理

同組數(shù)據(jù)采用方差分析。

2 結(jié)果

2．1 穩(wěn)定細胞株的建立

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細胞后，經(jīng)G418培養(yǎng)基篩選25 d，可得穩(wěn)定傳代的細胞株。由圖1可見，單克隆在逐漸增大。經(jīng)轉(zhuǎn)染重組后的細胞比普通的HEK-293細胞更脆弱，因此培養(yǎng)期間需要頻繁觀察生長狀況，并及時更換新鮮培養(yǎng)基。第25天，細胞生長狀態(tài)已趨于穩(wěn)定，可用于凍存及擴大培養(yǎng)。

圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后不同天數(shù)的HEK-293細胞株（明場，×200）

轉(zhuǎn)染后的細胞模型和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK-293細胞分別用陽性藥物脂多糖處理，檢測其熒光素酶強度。陽性藥物組的熒光素酶活性為36．71±6．38，是空白組熒光素酶活性0．28±0．03的100倍以上（比值為131±27．73），表明該細胞模型可有效刺激相應(yīng)具有生理活性的藥物，證明該細胞模型可用于藥物的篩選。

2．2 17個藥物單體對細胞模型的抑制率

細胞毒性試驗結(jié)果見圖2。其中1～15號單體在100μmol／L濃度下，VEGF-293細胞的存活率均大于90%，表明在此濃度下安全。而16號和17號單體對VEGF-293細胞的存活率低于90%，說明毒性較大，其安全濃度均低于10μmol／L。故熒光素酶試驗對1～15號單體均采用100μmol／L作為篩選濃度，對于16號和17號單體均采用10μmol／L作為篩選濃度。

圖2 100μmol／L濃度下不同單體對VEGF-293細胞增殖率的影響

2．3 17種單體對于VEGF基因啟動子的激活效果

結(jié)果見圖3和表2。由圖3可知，2，4，5，6，9，12號化合物對VEGF啟動子的激活率超過150%，篩選結(jié)果呈陽性。其中，2，6，12的激活作用是陰性對照組的20倍以上。提示“3個藏藥”在給藥過程中，發(fā)揮的血管保護和再生作用可能主要和2，6，12號化合物有關(guān)。

圖3 17個單體成分對VEGF基因啟動子的作用

表2 各中藥單體對基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

阿魏酸、川芎嗪和芒果苷系“3個藏藥”方中激活VEGF基因啟動子作用有效的單體化合物，是其經(jīng)典方中抗腦缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)。阿魏酸具有抗氧化、抗血栓和調(diào)血脂的作用，臨床應(yīng)用富含阿魏酸的當歸、升麻等常用于血管性疾?。淮ㄜ亨壕哂懈纳莆⒀h(huán)、降低外周阻力、擴張血管等藥理作用，均與VEGF基因的激活相關(guān)。芒果苷有潛在開發(fā)為血管類新藥的可能。

3 討論

藏醫(yī)藥學(xué)在約2 300年前發(fā)源于干旱、缺氧的青藏高原，在缺血、缺氧疾病方面有獨到的臨床經(jīng)驗。藏醫(yī)學(xué)中，腦缺血被稱為“白脈病”，治療的主要內(nèi)服方劑有二十五味珍珠丸、如意珍寶丸、十五味沉香丸、十三味鵬鳥丸等[1，8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究已證實，藏藥在治療腦缺血方面有顯著療效，但藏藥處方龐大，成分復(fù)雜，如何確定龐雜藥材成分中的微量有效成分，本研究中提出擬借助分子生物學(xué)手段建立一種準確、快速的方法，可作為新藥篩選的工具，也為藏藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了良好的手段。VEGF的調(diào)控范圍不僅和腦缺血后的損傷恢復(fù)有關(guān)，也對應(yīng)了“3個藏藥”的治療范圍。因此以此作為靶基因來尋找復(fù)雜中藥體系中的有效成分，不但可用于藥效和成分的研究，還可為臨床定向治療提供幫助。

本研究中構(gòu)建了腦缺血相關(guān)基因的藥物篩選模型，并通過陽性藥物驗證了其有效性。且用該模型對“3個藏藥”中含有的主要成分進行篩選，找到了其中VEGF基因啟動子激活作用最有效的幾種化學(xué)成分。該結(jié)果既為藏藥的藥理作用、信號通路等的進一步深入研究提示了方向，又為藏藥質(zhì)量標準控制提供了參考。此外，現(xiàn)有體外細胞篩選模型多以受體的結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄因子等作為研究對象。這種以單一靶點的模型只能得到針對某一個單獨位點的有效物質(zhì)。而本研究中采用能否激活基因啟動子的序列作為篩選條件，基因的啟動子序列中往往含有多個不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，因此本研究的篩選模型可篩出能作用于目標基因表達的一大類物質(zhì)，不僅可保證該基因作用的特異性，也能大大地擴展篩選范圍。

本研究關(guān)于藏藥藥效的探索只停留在某種化合物可激活啟動子的層面上，尚不夠深入。首先，VEGF受到許多因子的調(diào)控[9]，待測藥物通過哪一個結(jié)合位點，或是怎樣的途徑來激活啟動子，仍需要對機制做更詳細地研究；其次，VEGF有種類繁多的靶基因，不僅具有促進血管再生的功能，也能通過影響其他因子來控制神經(jīng)再生、缺氧應(yīng)答等[10-11]。本研究中僅能得知該化合物可激活該基因的啟動子，其具體的藥效還有待進一步研究。本研究中雖然證明了該化合物能激活啟動子，但無法得知該基因mRNA的量有無上升，以及能否進一步體現(xiàn)在蛋白質(zhì)表達層面上。因此，本研究中只是為中藥復(fù)雜體系的有效物質(zhì)尋找提供一個初篩的手段，仍有許多改進完善和進一步研究的空間。