雙龍方對離體大鼠冠狀動脈舒縮功能的影響及機制*

余丞浩，王建農(nóng)，張金艷

（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091）

雙龍方是李連達院士在治療心血管疾病方面的臨床經(jīng)驗方，是根據(jù)益氣活血化瘀原理，以具有益氣功效的人參配伍活血化瘀功效的丹參組方的中藥復方制劑，具有益氣養(yǎng)血、活血通脈的功效，用于氣虛血瘀（本虛標實）之胸痹證，適用于心血管突發(fā)性疾病，療效顯著。本研究的前期研究中分別建立了犬[1]、小型豬[2]、大鼠[3]心肌梗死模型，結(jié)果表明，雙龍方對以上冠狀動脈結(jié)扎所致心肌梗死模型均有明顯治療作用。進一步觀察了雙龍方對犬血流動力學的影響，主要有減慢心率，降低心肌耗氧、增加冠狀動脈血流量等作用[4]，其作用機制尚不明確。近期的試驗結(jié)果顯示，雙龍方可有效防治心肌缺血-再灌注后的無復流現(xiàn)象[5]，并有顯著擴張大鼠腸系膜動脈的作用，該作用與抑制電壓依賴型鈣離子通道功能及5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NA）受體功能有關(guān)[6]。但冠狀動脈形成起源、生物學特點及藥理學特點均不同于其他血管[7-8]，本研究中擬進一步研究其對大鼠離體冠狀動脈舒縮功能的影響，進而闡述雙龍方對心血管活性作用的機制，為雙龍方治療心血管疾病提供試驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 動物、試藥與儀器

動物：清潔級，6～7周齡雄性，SD大鼠20只，體質(zhì)量220～300 g，由北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2016-0002。

試藥：氯化鉀（KCl，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20170526）；5-HT（Sigma公司，批號為SLBP9361V）；血栓素A2受體激動劑（U46619，Chem Cruz公司，批號為G2717）；雙龍方由人參提取顆粒（2．5 g生藥／g）與丹參提取顆粒（10 g生藥／g）按人參、丹參生藥比例7∶3配制，由中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院提供。藥品和試劑均于臨用前以0．9%氯化鈉溶液配置。

儀器：DMT620型多腔離體微血管金屬絲肌動描記儀（ADInstruments Co．，Australia）；精密pH計（Mettler-Toledo Instruments Co．，Shanghai）；連續(xù)變倍體視顯微鏡（Nikon Instruments Co．，Shanghai）。

1．2 方法

離體動脈環(huán)制備：頸椎脫臼處死大鼠，分離冠狀動脈，放入冷的Krebs液（由氯化鈉119 mmol／L，氯化鉀4．6 mmol／L，氯化鈣1．5 mmol／L，磷酸二氫鈉1．2 mmol／L，氯化鎂1．2 mmol／L，碳酸氫鈉15 mmol／L，葡萄糖5．6 mmol／L[9]組成），顯微鏡下繼續(xù)分離冠狀動脈，去除周圍黏附組織。將處理好的動脈剪為1．5 mm長的圓筒段，即冠狀動脈環(huán)，4℃保存，備用。

標本掛置及血管活性篩選：顯微鏡下，以2根25μm的鎢絲穿入冠狀動脈環(huán)內(nèi)腔，分別以螺絲將2根鎢絲的兩端固定于肌動描記儀的器官浴槽中。浴槽內(nèi)盛37℃、pH 7．4的Krebs液，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體[10]。調(diào)節(jié)動脈環(huán)基礎(chǔ)張力至1．5 mN，平衡1．5 h。

藥物濃度設(shè)置：將雙龍方顆粒用0．9%氯化鈉溶液溶解，配置成所需質(zhì)量濃度。除研究低、中、高質(zhì)量濃度（相當于每1 L中含8，16，32 g生藥）雙龍方對血管的直接擴張作用外，根據(jù)直接舒張作用研究中的結(jié)果，考慮機制研究中需要降低雙龍方溫育時對血管環(huán)平衡后基礎(chǔ)張力的影響，以防干擾對機制的研究，故選取效應(yīng)研究中藥物起效濃度的低濃度組，作為該機制研究中的高濃度組。

對大鼠冠狀動脈的直接舒張作用：分別用10-5mol／L的5-HT和5×10-7mol／L的U46619收縮血管，張力穩(wěn)定后，將低、中、高質(zhì)量濃度（每1 L含8，16，32 g生藥，設(shè)為Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組）的雙龍方加入器官浴槽，其中空白對照組（Ⅰ組）加等量0．9%氯化鈉溶液，考察其對冠狀動脈的直接舒張作用。舒張率分別以相對于10-5mol／L 5-HT和5×10-7mol／L U46619預收縮高度的百分比表示。

對電壓依賴型鈣離子通道功能的影響：檢驗血管活性良好、張力穩(wěn)定后，將低、中、高質(zhì)量濃度（每1 L含2，4，8 g生藥，設(shè)為B，C，D組）的雙龍方加入器官浴槽溫育5 min，空白對照組（A組）加等量0．9%氯化鈉溶液，各組按累加濃度法加入KCl，記錄血管對KCl收縮的量-效曲線，分別計算最大收縮（Emax）及產(chǎn)生最大效應(yīng)1／2時所需藥物的負對數(shù)（pEC50）。

表1 不同質(zhì)量濃度雙龍方對預收縮大鼠冠狀動脈的舒張作用比較（均數(shù)±標準誤，n=8）

對受體依賴型鈣離子通道功能的影響：檢驗血管活性良好、張力穩(wěn)定后，將低、中、高質(zhì)量濃度（每1 L含2，4，8 g生藥，設(shè)為B，C，D組）的雙龍方加入器官浴槽溫育5 min，空白對照組（A組）加等量0．9%氯化鈉溶液，各組分別按累加濃度法加入血管收縮性G蛋白偶聯(lián)受體激動劑（5-HT，U46619），分別計算其Emax及pEC50。

1．3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS統(tǒng)計學軟件分析。組間數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性用Student-Newman-Keuls檢驗；方差不齊用Tamhane′s T2檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 對大鼠冠狀動脈的舒張作用

結(jié)果見表1和圖1。雙龍方各組舒張率與Ⅰ組比較，均有顯著性差異（P＜0．01）。

圖1 雙龍方對預收縮大鼠冠狀動脈的舒張作用（n=8）

2．2 對電壓依賴型鈣離子通道功能的影響

結(jié)果見表2和圖2。與A組比較，D組KCl最大收縮達5-HTEmax顯著降低（P＜0．05）；各組間pEC50無顯著差異。

表2 不同濃度雙龍方對大鼠冠狀動脈KCl量-效曲線的影響（均數(shù)±標準誤，n=8）

圖2 雙龍方對大鼠冠狀動脈KCl量效曲線的影響（n=8）

2．3 對受體依賴型鈣離子通道功能的影響

結(jié)果見圖3和表3、表4。與A組比較，B，C，D組5-HT的Emax均顯著降低（P＜0．01），各組間pEC50無顯著差異；與A組比較，C組、D組U46619的Emax均顯著降低（P＜0．01），各組間pEC50無顯著差異。

3 討論

圖3 雙龍方對大鼠冠狀動脈量效曲線的影響（n=8）

表3 不同質(zhì)量濃度雙龍方對大鼠冠狀動脈5-HT量-效曲線的影響（均數(shù)±標準誤，n=8）

表4 不同質(zhì)量濃度雙龍方對大鼠冠狀動脈U46619量-效曲線的影響（均數(shù)±標準誤，n=8）

通過中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫，以詞頻“大鼠”并含“冠狀動脈”并含“收縮”或“舒張”為主題詞檢索1979年至2018年微血管文獻，共檢索到文獻111篇，通過逐一閱讀文獻摘要排除81篇，保留相關(guān)度高的共30篇，其中1991年1篇，1996年1篇，2011年1篇，2013年至2015年12篇，2016年至2018年15篇?？梢?，隨著儀器設(shè)備的應(yīng)用開發(fā)與分離技術(shù)的提高，大鼠冠狀動脈環(huán)張力測定試驗應(yīng)用在心血管藥物的研究方面正逐漸興起。

大鼠的微血管尤其是冠狀動脈因其壁薄腔小，難以從組織完整分離而不損傷平滑肌，穿金屬絲行張力測定時又極易損傷血管內(nèi)皮，因此分離大鼠冠狀動脈行張力測定的操作難度遠遠大于大鼠的大血管及大型動物（豬、犬、兔等）的微血管。

通過查閱文獻[5]和實際操作，整理和總結(jié)分離大鼠冠狀動脈時，需注意以下幾點：避免麻醉藥對某些血管平滑肌的功能造成影響，進行血管張力測定試驗的大、小鼠應(yīng)盡量采用頸椎脫臼處死法；應(yīng)迅速盡可能排空離體心臟里殘留淤血，固定在黑色背景襯托的培養(yǎng)皿內(nèi)，便于血管的觀察與分離；盡量降低組織代謝，保持血管良好的活性，血管的分離過程宜在冰浴下進行，同時，整個分離過程宜敏捷而迅速，如單人操作制備4個血管環(huán)樣本宜控制在40 min以內(nèi)完成；游離血管時不要鉗夾、牽拉血管，以免損傷平滑肌，外周的脂肪組織要盡可能地去除干凈；裁取金屬絲兩端宜使用銳利的器械（如手術(shù)剪）剪去，避免金屬絲兩端曲折變形或有鈍芒，進而減少穿越阻力和防止刺傷血管；穿血管的金屬絲端應(yīng)一直保持筆直狀態(tài)，避免中途折曲而損傷血管內(nèi)皮，在穿金屬絲時手要穩(wěn)，盡量在血管腔中間一次性穿過，避免鋼絲反復摩擦到管壁平滑??；張力測定全程通以混合氣，氣流的速度應(yīng)控制好（以3～5個氣泡／秒為宜）；掛置完血管環(huán)后，設(shè)置好與血管環(huán)相匹配的、適宜的標準化初始張力，然后再正式進行試驗。由此可知，操作中保持血管平滑肌的完整性與良好活性是血管張力測定試驗得以進行的前提。本試驗中通過對分離大鼠冠狀動脈試驗技術(shù)的掌握，為本項研究提供了技術(shù)保障。

血管收縮功能的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是血管平滑肌，血管平滑肌細胞上L型鈣離子通道對血管張力的調(diào)節(jié)起重要作用[11]。根據(jù)其調(diào)控通道開閉機制的不同，平滑肌細胞膜上的鈣離子通道主要可分為電壓依賴型和受體依賴型。電壓依賴型鈣離子通道（VDCC）隨著細胞膜去極化而開放，與膜電壓變化相關(guān)；受體依賴性鈣離子通道（RDCC）主要通過平滑肌細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，誘導其開放[6]。平滑肌的收縮調(diào)節(jié)主要通過電壓依賴性鈣離子通道的調(diào)控[12]。

血栓素A2（TXA2）、5-HT是常見的2種血管舒縮性介質(zhì)。TXA2主要由血小板中的前列腺素H2在TXA2合酶作用下生成，有促進血小板聚集和收縮血管平滑肌作用，參與多種心血管疾病及腎臟疾病的發(fā)生[13]。TXA2收縮血管平滑肌的作用機制為激活環(huán)核苷酸門控通道引起細胞內(nèi)鈣增加[14]及激活TXA2受體和磷脂酶C（PLC）[15]。

5-HT又名血清素，為常見的神經(jīng)遞質(zhì)及血管收縮劑，其受體主要有5-HT1R，5-HTZR，5-HT3R，5-HT4R，5-HT5R，5-HT6R和5-HT7R 7種類型和14種亞型[16-17]。除5-HT3R屬配體門控通道外，其余6種均為G蛋白偶聯(lián)受體。在這些受體中，5-HT2A與5-HT1D受體主要位于血管平滑肌細胞上，當機體內(nèi)源性釋放的5-HT與5-HT2A受體結(jié)合后，可促進細胞外鈣離子內(nèi)流，使得血管迅速產(chǎn)生收縮反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，雙龍方可濃度依賴性地舒張5-HT和U46619所引起的大鼠冠狀動脈收縮，有顯著直接擴張冠狀動脈血管的作用。雙龍方舒張血管的作用機制與抑制電壓依賴型鈣離子通道開放有關(guān)，且能干預5-HT和TXA2所介導的血管收縮效應(yīng)，推測雙龍方舒張大鼠冠狀動脈的作用與抑制二者受體有關(guān)。

本研究中以大鼠離體微血管組織（冠狀動脈）為試驗對象，進一步驗證了雙龍方可改善大鼠的心臟微循環(huán)功能。但本研究中所用中藥顆粒劑（人參、丹參）由于提取工藝限制，僅涉及多種水溶性成分，不含脂溶性成分，今后可以考慮從配伍組分學的角度，以人參、丹參水溶性和脂溶性成分作相關(guān)試驗設(shè)計及探討。此外，隨著研究微血管技術(shù)的提高與相關(guān)儀器的開發(fā)、改進，今后的研究也可關(guān)注腦部微血管疾病，以期能發(fā)現(xiàn)新的藥理活性作用，從而為拓展中藥復方的臨床應(yīng)用范圍提供試驗依據(jù)。

志謝：導師李連達院士生前在雙龍方基礎(chǔ)試驗研究方面，傾注了較多心血，有幸作為他的學生并得到其諄諄教導，不勝感恩！