循環(huán)腫瘤細(xì)胞在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義研究

駱許靜 馬耀先 孫 楨 方曉瑞 申曉燕

肺癌是1種全世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，它起源于支氣管黏膜及腺體，發(fā)病率極高，其發(fā)病率及死亡率高居惡性腫瘤之首，并且其發(fā)病率逐年升高[1]，2017年的研究數(shù)據(jù)表明，全國惡性腫瘤發(fā)病第1位的是肺癌，每年新發(fā)病例約73.3萬[2]。目前，傳統(tǒng)診斷有局限性[3]，不能檢測到循環(huán)血液中的癌細(xì)胞和其他器官中的微小轉(zhuǎn)移灶，許多患者因遠(yuǎn)處器官和組織的轉(zhuǎn)移而復(fù)發(fā)，部分初期肺癌將會發(fā)展為晚期的肺癌，給患者帶來極大的痛苦。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，提前控制病情是治療肺癌有效方法，但由于該疾病前期癥狀不明顯，亟需1種靈敏的診斷方法[4]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)是從原發(fā)腫瘤或者轉(zhuǎn)移灶上脫落后進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，CTC在腫瘤的研究中得到廣泛的應(yīng)用[5]，CTC逐漸體現(xiàn)出多種癌癥診斷方面的價值[6]。研究顯示[7-8]， CTC檢測在肺癌中也表現(xiàn)較好的敏感性和特異性。本研通過CTC檢測與臨床相結(jié)合，探討CTC檢測對診斷肺癌疾病及其轉(zhuǎn)歸的臨床價值，以期CTC能夠在肺癌診斷、治療和預(yù)后評估中得到更廣泛的應(yīng)用，為醫(yī)學(xué)界同仁提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

肺癌患者組：選取自2016年3月至2017年5月在我院就診的60例肺癌患者,其中男性26例,女性34例，平均年齡為62.2歲，38～80歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)胸部CT掃描及其他組織病理學(xué)檢查確診為肺癌患者；②年齡在18～80歲；③入組前未接受任何抗腫瘤治療。非結(jié)核的肺良性疾病患者組：選取自2016年3月至2017年5月在我院就診的10例肺良性疾病患者，其中男性7例，女性3例，平均年齡為61.9歲，37～80歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理學(xué)檢查排除肺惡性腫瘤；②符合非腫瘤相關(guān)疾病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；③有微生物學(xué)或組織學(xué)證據(jù)。另選取健康志愿者10例，男性6例，女性4例，平均年齡為53歲(28～69歲)。三組受試者在性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有受試者均簽署了知情同意書,經(jīng)倫理委員會審查通過。根據(jù)胸部CT、B超和纖維支氣管鏡的臨床檢測結(jié)果，其中小細(xì)胞肺癌患者11例，非小細(xì)胞肺癌患者49例；依據(jù)第八版國家肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期10例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例、Ⅳ期12例。

1.2 方法

首先采集所有患者靜脈血7.5 ml，加入到ACD抗凝試管。加入6.5 ml磷酸鹽緩沖液混入其中，充分搖勻，以2000 rpm室溫離心15 min，離心3次。將富積到的細(xì)胞均勻涂在玻片上，使用抗體混合液(人鼠抗Pan-細(xì)胞角蛋白CK，生產(chǎn)廠家:上海賓智生物科技有限公司)和封片液(4，6-二脒基-2-苯基吲哚購自invitrogen公司)染色。最后采用免疫熒光顯微鏡(購自雅培公司)進(jìn)行觀察，查找腫瘤細(xì)胞。以對數(shù)生長的肺腺癌A549細(xì)胞株為陽性對照組，以PBS代替一抗為陰性對照組，防止樣本出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，如樣本紅細(xì)胞裂解不完全導(dǎo)致成團(tuán)、樣本紅細(xì)胞裂解后溶血。整個過程注意無污染、避光操作。

1.3 CTC的判定標(biāo)準(zhǔn)

形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長形，體積明顯大于血細(xì)胞；②光鏡下可見完整細(xì)胞形態(tài)。CTC免疫熒光染色結(jié)果判定：可以同時被CK和DAPI染色，不能被CD45染色。目前尚無國際標(biāo)準(zhǔn)化的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)以見到CTC即為陽性結(jié)果。出現(xiàn)陽性結(jié)果的患者在整個組中的比率即為陽性率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPASS 20.0軟件對獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者組、良性肺疾病患者組和健康空白對照組中CTC數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

肺癌患者組中CTC陽性率達(dá)80%(48/60),在良性肺疾病患者組和健康空白對照組中CTC陽性率為零，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 不同類型肺癌及不同分期肺癌患者CTC陽性率的分析

不同的肺癌類型CTC陽性率比較發(fā)現(xiàn)，循環(huán)細(xì)胞的陽性率與性別、肺癌類型無明顯關(guān)系(P>0.05),而Ⅰ期肺癌患者中CTC陽性率(40.00%)顯著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的CTC陽性率(85.71%、88.24%、100.00%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同類型及不同分期肺癌患者CTC陽性表達(dá)情況(例，%)

3 討論

近年來肺癌的發(fā)病率不斷升高，肺癌轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散也越來越復(fù)雜，傳統(tǒng)的肺癌檢測手段精確度與靈敏度受到一定的挑戰(zhàn)，臨床上頻繁出現(xiàn)肺癌的誤診情況[9-10]，不斷有研究者對傳統(tǒng)的診斷手段提出質(zhì)疑，并且傳統(tǒng)的檢查方法很容易對患者造成有創(chuàng)傷害。為了能夠減少臨床誤診情況，更加合理的對肺癌患者進(jìn)行診斷、治療、預(yù)后評估，需要綜合運(yùn)用多種檢測技術(shù)對患者進(jìn)行多角度、全方位、深層次的診斷[11]。檢測肺癌患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞手段作為一種新的肺癌的判斷方法越來越受大家重視，是目前臨床研究的熱點(diǎn)[12]。CTC的檢測手段已在乳腺癌中得到廣泛的應(yīng)用[13]，其符合率達(dá)到95%～100%，并且對卵巢癌、晚期直腸癌和前列腺癌的診斷、治療、預(yù)后評估具有指導(dǎo)作用[14]。隨著Ficoll離心法和免疫磁珠法等CTC富集技術(shù)，流式細(xì)胞計數(shù)和聚合酶聯(lián)反應(yīng)等CTC鑒定技術(shù)以及CTC芯片技術(shù)的應(yīng)用[15]，CTC的檢測的敏感性和特異性越來越高[16-17]。若這些新技術(shù)的能廣泛應(yīng)用于臨床，將會極大有助于肺癌的診治和預(yù)后判斷，預(yù)測肺癌的轉(zhuǎn)移情況，盡早采取有效的治療措施，提高肺癌患者的存活率。

我們通過對60例肺癌患者、10例良性肺疾病患者、10例健康對照著中外周血CTC的數(shù)量進(jìn)行研究，統(tǒng)計結(jié)果顯示肺癌患者的CTC陽性率明顯高于良性肺疾病和健康對照組。并對不同性別和不同肺癌類型的CTC陽性率進(jìn)行比較，其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而不同肺癌分期的CTC陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此研究結(jié)果與陳燕、鐘光華等人的研究結(jié)果基本一致[18-19]。說明CTC檢測具有一定的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。但是CTC的評判標(biāo)準(zhǔn)和方法并未統(tǒng)一，為CTC檢測的廣泛應(yīng)用帶來一定困難，因此進(jìn)一步提升肺癌中CTC檢測的臨床應(yīng)用價值對肺癌患者的診斷、治療和預(yù)后評估具有重大的臨床意義。