Survivin及Klotho在胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織及癌旁組織中的臨床表達(dá)

孫虹燕

胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是表現(xiàn)的特殊類(lèi)型的胃結(jié)腸癌，具有內(nèi)分泌功能。該種癌癥于1980年被世界衛(wèi)生組織以神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤范疇劃分[1-3]，根據(jù)部位分為：十二指腸、胃、結(jié)腸、小腸等，主要分為內(nèi)分泌無(wú)功能及有功能，其中內(nèi)分泌無(wú)功能為主要的臨床表現(xiàn)。該類(lèi)疾病前期內(nèi)分泌瘤無(wú)功能性、無(wú)特異性表現(xiàn)，因此早期常難以發(fā)現(xiàn)，診斷時(shí)間平均5～7年，且基本確診為晚期癌癥。近年來(lái)隨著螺旋CT、內(nèi)徑、PET等先進(jìn)檢測(cè)方法的廣泛使用，胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌的診斷水平得以大幅度提高。胃腸道惡性腫瘤中胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌占0.4%～1.5%[4]。根據(jù)大量資料顯示，胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌的不典型特點(diǎn)是主要臨床表現(xiàn)之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，60%以上患者確診時(shí)已處于終晚期，且患病已趨于低齡化。手術(shù)是治療胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌的主要方法，一般手術(shù)及恢復(fù)情況較好，術(shù)后腫瘤直徑小于2 cm，較差的有腫瘤轉(zhuǎn)移者或腫瘤直徑大于2 cm，最差的主要為小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌癥及多病灶或混合性類(lèi)癌患者[5]。研究證明Survivin及Klotho均在該類(lèi)癌癥患者有一定的異常表達(dá)，因此，本文通過(guò)回顧性分析96例胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者病例材料，分析Survivin及Klotho在該類(lèi)患者中的表達(dá)，為胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者的治療提供臨床數(shù)據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2015年12月至2017年12月在本院就診的96例胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者病例材料，患者平均年齡為(47.37±9.65)年；患者中男性76例，女性20例；根據(jù)國(guó)際臨床標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期55例，Ⅲ期8例，Ⅳ期24例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情并同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌的患者；未合并其他免疫性疾病的患者；臨床資料及隨訪資料完整的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他免疫性疾病的患者；有其他重大疾病史的患者；患者及家屬不配合者。

1.3 研究方法

蛋白質(zhì)印跡法：將1 g組織塊置于1～2 ml勻漿器中球中部位，組織塊用干凈的剪刀盡量剪碎；以目標(biāo)抗體的份子量大小為標(biāo)準(zhǔn)，配置合適百分比的凝膠電泳，于凝膠加樣緩沖液中放置原樣品，加熱3 min使蛋白質(zhì)變性，按預(yù)定順序加樣，做好實(shí)驗(yàn)記錄；將200 v電壓與電泳裝置連接好，在溴酚藍(lán)遷移到分離膠底部0.5 cm處時(shí)，關(guān)閉電源；用去離子水沖洗干凈凝膠玻璃板。準(zhǔn)備進(jìn)行免疫印跡操作。

免疫印操作：在盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中浸泡凝膠玻璃板15～20 min；在緩沖液中浸泡膜于電泳，驅(qū)除膜上的氣泡，后放置于濾紙上，避免氣泡的產(chǎn)生；將攪拌子放于離子水清洗緩沖后的液槽中，用緩沖液浸透另一塊海綿墊后放置凝膠膜上，后關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒，放入轉(zhuǎn)移槽；恒壓100 v轉(zhuǎn)移90 min，后在5%的脫脂奶粉中以37 ℃恒溫封閉2 h。

免疫檢測(cè)：用蒸餾水將加樣槽洗滌潤(rùn)洗干凈，晾干，用一次性手套覆蓋好膜，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)和標(biāo)記切下膜條放于加樣槽中，做好實(shí)驗(yàn)記錄，溫室下孵育2 h。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

用顯微鏡高倍鏡觀察，survivin及Klotho主要在組織細(xì)胞質(zhì)著色，陽(yáng)性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)為組織切片中胞質(zhì)染為黃色至棕黃色者。凡顯色強(qiáng)度與背景無(wú)明顯差異者為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Survivin在胃腸道內(nèi)分泌癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及相關(guān)因素

對(duì)患者進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，可知胃腸道內(nèi)分泌癌患者癌組織中小細(xì)胞癌Survivin表達(dá)(35/38)高于大細(xì)胞癌(26/58)，癌旁組織無(wú)Survivin表達(dá)，對(duì)96名患者分別從手術(shù)時(shí)是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、腫瘤大小、性別、分化等級(jí)及病理分期等方面分析Survivin表達(dá)關(guān)聯(lián)因素，可知組織分化較好的組織中Survivin的表達(dá)低于分化較差者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅳ期患者的Survivin陽(yáng)性表達(dá)高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 Klotho在胃腸道內(nèi)分泌癌組織中的表達(dá)

通過(guò)免疫組化檢測(cè)96例患者的Klotho表達(dá)，可知小細(xì)胞癌中Klotho表達(dá)(9/40)明顯低于大細(xì)胞癌(32/56)，癌旁組織中Klotho均為陽(yáng)性強(qiáng)表達(dá)且均呈陽(yáng)性表達(dá)，癌組織Klotho陽(yáng)性反應(yīng)位點(diǎn)較弱。進(jìn)一步分析Klotho與患者臨床特征可知，組織分化好的患者Klotho表達(dá)高于差者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而根據(jù)分期Ⅳ期患者中無(wú)Klotho表達(dá)，Ⅰ期全部表達(dá)，Ⅱ期表達(dá)27例，Ⅲ期表達(dá)2例，4組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3 討論

胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌具有神經(jīng)內(nèi)分泌功能，其病理分型包括混合型癌、類(lèi)癌及小細(xì)胞癌，演化過(guò)程呈現(xiàn)增生-異型增生的特點(diǎn)。Survivin是1種凋亡抑制基因，在細(xì)胞的分裂中能夠檢測(cè)到其表達(dá)[6-7]。Survivin與微管的相互作用一旦中斷或者障礙，半胱氨酸蛋白酶3的活性將會(huì)增加，使得細(xì)胞的凋亡加速。因此腫瘤的進(jìn)展與Survivin的表達(dá)有著密切關(guān)系[8-9]。

表1 Survivin、Klotho在胃腸道內(nèi)分泌癌組織表達(dá)的相關(guān)因素/例

研究結(jié)果證明，胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者的死亡率、復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)與Survivin呈正相關(guān)，且在多種癌癥中，判斷患者的預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)是Survivin是否陽(yáng)性表達(dá)[10-11]。本文通過(guò)對(duì)胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織和癌旁組織中Survivin的表達(dá)情況運(yùn)用免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，可知Survivin的表達(dá)癌組織高于癌旁組織。進(jìn)一步分析Survivin的表達(dá)因素可知其表達(dá)與組織分化、病理分期有密切關(guān)系，且在臨床分期Ⅳ期中的陽(yáng)性表達(dá)為100%。Klotho基因是一種抑制衰老的有效基因，許多癌癥與衰老之間有不同相關(guān)性。本文通過(guò)運(yùn)用免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織和癌旁組織中Klotho的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Klotho的表達(dá)在癌組織中較弱。在瘤細(xì)胞中抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞內(nèi)胰島素可能是Klotho蛋白的作用。而胰島素樣生長(zhǎng)因子是與癌癥風(fēng)險(xiǎn)和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，雷帕霉素調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及血管生成均為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[12]。

綜上所述，胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者中，Survivin陽(yáng)性表達(dá)于癌組織高于癌旁組織，小細(xì)胞癌高于大細(xì)胞癌；大細(xì)胞癌Klotho陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁組織，小細(xì)胞癌Klotho陽(yáng)性表達(dá)低于大細(xì)胞癌。