ZEB2蛋白表達和E-caderin 蛋白在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的臨床意義

羅慶豐 修穆群 高 文 羅淑蘭 楊 劍 張小芳 付愛榮

鼻咽癌是我國常見的頭頸惡性腫瘤,早期轉(zhuǎn)移是其主要的臨床癥狀,局部復發(fā)是影響治療效果的主要原因，我們通過研究鼻咽癌的患者腫瘤組織的ZEB2的表達狀態(tài)，探索腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)機制，降低腫瘤復發(fā)率，改善治療效果，提高患者生存時間。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2009年3月至2012年5月收集132例在江西省腫瘤醫(yī)院治療鼻咽癌患者，其中男性∶女性為73∶59，年齡27～70歲，中位年齡56歲；患者均經(jīng)病理檢查確診為非角化性癌，收集患者5年隨訪資料。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 試劑 ZEB2蛋白單克隆抗體(即用型)及MaxvisionTM免疫組化試劑盒購自公司，ZEB2蛋白為羊抗人原液，參考滴度1∶200。

1.2.2 方法 ZEB2和E-caderin蛋白檢測采用MaxvisionTM免疫組化法，操作按說明書進行：①4 μm厚度切片，裱于涂有APES的防脫載玻片上，70 ℃烤片1 h;②脫蠟，逆梯度乙醇入水；③ 3%過氧化氫室溫孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；④抗原修復：切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中，電飯鍋中煮沸5 min，保溫10 min，自然冷卻；PBS洗,3 min×2次；⑤加入ZEB2抗體，4 ℃冰箱12 h；⑥復溫，PBS洗去一抗3 min×2次；⑦滴加抗體增強劑；⑧ 滴加Maxvision試劑，室溫作用1 h；⑨PBS洗3 min×2次；⑩DAB光鏡下顯色，蘇木精復染，封片。光鏡下觀察ZEB2蛋白在鼻咽癌中表達。陽性對照：購自英國Abcam公司ZEB2蛋白乳腺癌陽性組織片。陰性對照：PBS代替一抗。

1.2.3 結(jié)果判斷 細胞細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒沉著者為ZEB2蛋白陽性表達。細胞細胞膜呈棕黃色顆粒沉著者為E-caderin蛋白陽性表達，選擇陽性表達區(qū)的4個高倍視野，記數(shù)400個以上細胞，根據(jù)腫瘤陽性細胞數(shù)及細胞染色強度進行半定量根據(jù)著色強度及顯色癌細胞比例將染色結(jié)果分為-、+、++和+++級；評分方法為：染色強度0分為無著色；1分為淺棕色; 2分為棕色，計; 3分為棕褐色。染色腫瘤細胞數(shù)百分比:0分為無陽性細胞; <10%，計1分; 10%～<50%，計2分; 50%～<75%，計3分;≥75%，計4分。最后評分結(jié)果為兩強度和百分比計分結(jié)果相乘之積，結(jié)果分為①陰性表達:<4分為(-);②陽性表達:評分≥4～<6分為(+),≥6～<9分為(++),9≥～<12分為(+++) 。

1.2.4 分期方法 按國際抗癌聯(lián)盟 UICC 分期第8版鼻咽癌分期標準對入組的鼻咽癌患者進行TNM分期。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性診斷通過MRI影像學確診。

1.3 統(tǒng)計方法

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理評價分析，采用非參數(shù)秩和分析spearman相關分析。

2 結(jié)果

2.1 ZEB2蛋白表達和E-caderin 蛋白與鼻咽癌臨床病理特征的關系

ZEB2蛋白和E-caderin 蛋白表達與淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移密切相關，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者和遠處轉(zhuǎn)移患者ZEB2陽性和E-caderin 蛋白表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)；ZEB2蛋白和E-caderin 蛋白陽性表達均與鼻咽癌TNM分期顯著相關(P<0.05)。ZEB2蛋白與鼻咽癌病理分型顯著相關(P<0.01)，見表1。

2.2 ZEB2蛋白與E-caderin蛋白表達的相關性

鼻咽癌組織中ZEB2蛋白表達與E-caderin蛋白陽性表達有顯著負相關性(P<0.05)，見表2。

表1 ZEB2蛋白與E-caderin蛋白表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系/例

表2 ZEB2蛋白與E-caderin 蛋白表達的關系/例

3 討論

鼻咽癌在我國南方高發(fā)的惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強，常常發(fā)生頸部轉(zhuǎn)移。癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesen-chymaltransition，EMT)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的1個重要的過程，癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細胞腫瘤細胞失去原有的形態(tài)結(jié)構、排列極性及細胞間的緊密連接架構，細胞表面黏附分子和細胞肌動蛋白微絲骨架重塑，最終瘤細胞由圓形轉(zhuǎn)變成梭形外觀同時具有較強遷移能力的間質(zhì)細胞表型的過程[1]。癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化廣泛參與癌巢的增殖、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移及間質(zhì)血管生成的調(diào)控，是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中關鍵步驟，本研究探究ZEB 家族調(diào)控的EMT及相關蛋白在鼻咽癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移機制中的作用，為鼻咽癌的治療提供了新的靶點。

鋅指增強子結(jié)合蛋白-2( (zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)是二鋅指蛋白家族的1個成員，含有兩個鋅指集群，N-末端鋅指簇(NZF)包含4個鋅指結(jié)構(3個CCHH，1個CCHC)，C-末端鋅指簇(CZF)包含3個CCHH鋅指結(jié)構，通過與相關DNA序列結(jié)合[2]，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄作用，是重要的細胞核轉(zhuǎn)錄因子，大量的體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)ZEB2介導了EMT的發(fā)生，通過EMT控制腫瘤細胞的播散，Xavier 等[3]通過對犬的乳腺癌癌細胞株研究發(fā)現(xiàn)ZEB2可以通過stat和CDH基因調(diào)控癌細胞浸潤能力，ZEB2可以通過TGF-β1轉(zhuǎn)錄因子作用，促進上皮的間質(zhì)轉(zhuǎn)化，該機制在腎細胞癌[4]和卵巢腫瘤[5]中得到證實。這與本研究結(jié)果ZEB2蛋白陽性表達與鼻咽癌的病理分化相關的結(jié)果相一致。ZEB2與E-cadherin 編碼基因的啟動子上的E2盒的[CACCT(G)]結(jié)合，抑制E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄，誘導細胞發(fā)生EMT，增強細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，E-cadherin表達的下調(diào)是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的關鍵事件[6]。E-cadherin表達的缺失與多種人體腫瘤相關，如大腸癌、食管癌、乳腺癌、胃癌等。實驗證明具有高侵襲能力的腫瘤細胞重新表達E-cadherin，則其侵襲能力喪失；相反抑制上皮細胞中 E-cadherin 的表達，可使得細胞獲得間質(zhì)細胞樣表型，侵襲遷移能力增強，本研究結(jié)果中顯示中ZEB2蛋白陽性表達與鼻咽癌TNM分期結(jié)果比較有顯著性差異，隨著分期升高表達率升高，表明ZEB2的高表達導致EMT的發(fā)生，促進了腫瘤的浸潤能力的提高。Brown 等[7]對乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)ZEB2 通過微小RNA-155和FOXP3路徑，負反饋調(diào)節(jié)ZEB2 表達，上調(diào)E-cadherin表達，抑制腫瘤細胞的EMT,E-cadherin表達的缺失使得細胞黏附能力降低，導致EMT的發(fā)生，細胞遷移運動能力增強，從而促進腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。Ren等[8]通過對口腔鱗狀細胞癌的研究也證明miR-200b可以通過上調(diào)ZEB2 表達,促進遷移和浸潤。本研究結(jié)果顯示ZEB2蛋白陽性表達與鼻咽癌轉(zhuǎn)移能力比較有顯著性差異，而且無轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和遠處轉(zhuǎn)移組陽性表達率逐步升高，表明ZEB2參與鼻咽癌的進展及轉(zhuǎn)移。

腫瘤ZEB 家族調(diào)控的EMT在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移機制中及預后中發(fā)揮重要作用，能夠成為治療干預鼻咽癌的新靶點。