丹紅注射液對缺血性中風(fēng)大鼠舌象的干預(yù)研究*

林筱潔 萬浩宇 李志威 周惠芬 虞 立 楊端昕 楊潔紅 萬海同△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州310006）

缺血性中風(fēng)又稱腦梗死，是中老年人群常見的急癥，且近年有發(fā)病年齡年輕化的趨勢，我國大概有10%～15%患者是45歲之前發(fā)病的［1]。因此缺血性中風(fēng)的早期防治是一個重要的研究方向。缺血性中風(fēng)的常見中醫(yī)證型為風(fēng)痰瘀阻證、痰熱腑實證、氣虛血瘀證等，血瘀既作為缺血性中風(fēng)的病理產(chǎn)物又作為致病因素，貫穿整個疾病過程［2]。“瘀生五邪”加劇腦缺血損傷［3]。 梗死證屬“血瘀證”者可占 40%［4]。 因此活血化瘀藥廣泛應(yīng)用于缺血性中風(fēng)的治療。丹紅注射液就是臨床廣泛使用的活血化瘀藥之一。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能有效治療缺血性中風(fēng)大鼠［5-6]，PET檢查顯示缺血灶減小，能抗氧化、抗血栓、抗凋亡、促進神經(jīng)元成熟，保護神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。因此研究丹紅注射液對缺血性中風(fēng)血瘀證的影響具有臨床參考價值。舌象臨床表征一直是臨床診斷的重要依據(jù)，舌質(zhì)紫暗、少腹部抵抗壓痛、脈澀等對血瘀證診斷的貢獻最大［7]。2011年修訂的血瘀證中西醫(yī)結(jié)合十二條診斷標(biāo)準(zhǔn)［8]及2016年修訂的實用血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［9]都可說明舌質(zhì)紫暗、舌下靜脈曲張、瘀血等舌象在血瘀證診斷中具有重要作用。臨床研究還發(fā)現(xiàn)舌象的改變與腦梗死患者血液中的纖維蛋白原水平和中性粒細(xì)胞計數(shù)有關(guān)，與急性腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損程度有關(guān)，還與患者的腦梗死部位有關(guān)［10-12]。觀察丹紅注射液對血瘀證相關(guān)舌象的改善作用具有重要研究價值和實際臨床意義。本研究參照文獻［13-16]對缺血性中風(fēng)大鼠血瘀證相關(guān)舌象進行分析，并研究其與腦梗死的相關(guān)性，同時觀察丹紅注射液治療后舌象的變化，證實丹紅注射液可以有效干預(yù)缺血性中風(fēng)大鼠血瘀證相關(guān)舌象并促進神經(jīng)功能恢復(fù)，為其臨床療效提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，鼠齡2～3個月，體質(zhì)量為270～280 g，共40只。購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心層流屏障內(nèi)，許可證號SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物與儀器 1）藥物：丹紅注射液（山東丹紅制藥有限公司提供，國藥準(zhǔn)字Z20026866，批號2018011035；玻璃安瓿每支裝10 mL，含丹參、紅花提取物）。丁苯酞注射液（石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20100041，批號 20170808，100 mL∶25 mg）。 特耐（注射用帕瑞昔布鈉針，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字J20080045，批號 T13127）。 2）儀器：佳能 IXUS1100HS型數(shù)碼照相機（1 210萬像素，佳能株式會社生產(chǎn)）；標(biāo)準(zhǔn)色卡（美國愛色麗公司生產(chǎn)）。栓線（2636-A4，線身直徑0.26 mm，北京西濃科技有限公司生產(chǎn)）；恒溫毯（型號TT160X80-1，張家港市科興碳纖維制品有限公司生產(chǎn)）。

1.3 分組與造模 SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、丹紅注射液組和丁苯酞組，每組5只。參考Longa等［17]報道的改良線栓法及文獻［18]，簡要方法如下。隨機選取雄性SD大鼠，術(shù)前12 h禁食，但不禁水，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，肌肉注射特耐1.4 mg/kg止痛。經(jīng)右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈將線栓入顱，并順其推進18～22 mm（自頸總動脈分叉處計算），稍遇阻力時即可停止前進，可造成大腦中動脈（MCA）血流的阻斷。缺血1 h后緩慢拔出線栓進行再灌注。另設(shè)假手術(shù)組，結(jié)扎右側(cè)頸總動脈近端及遠(yuǎn)端，不插入線栓。大鼠手術(shù)中注意保溫，均放置于恒溫毯上，直至術(shù)后清醒。

1.4 給藥方法 給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算，丁苯酞注射液組按照成人用量［50 mg/60（kg·d），靜脈滴注，每日2次，每次25 mg]的6.25倍，計算大鼠用量為0.52 mg/100（g·d）。丹紅注射液組按照成人用量［40 mL/60 （kg·d）]的 6.25 倍，計算大鼠用量為0.42 mL/100（g·d）。分別于手術(shù)前0.5 h和再灌注即刻、再灌注后3、6、18 h尾靜脈注射相應(yīng)藥物各1次。假手術(shù)組和模型組大鼠則在同樣時間點注射無菌0.9%氯化鈉注射液 0.42 mL/100 （g·d）。

1.5 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分［17]在大鼠清醒后于再灌注23 h（術(shù)后24 h）觀察神經(jīng)缺損程度，由3人判斷、按4分制進行行為學(xué)計分。0分：無障礙；1分：不能完全伸左側(cè)前肢；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向左側(cè)傾倒；4分：意識不清，無自主活動。

1.6 大鼠舌象圖像采集和分析 拍攝部位：舌腹面、舌背面。大鼠處于深麻醉狀態(tài)下取仰臥位，用鑷子輕輕夾住大鼠舌尖從左輕輕拉出，直至露出舌根部，使整個舌體與大鼠軀干呈直線或有小于15°的夾角。于術(shù)后24 h約下午4∶00在同一室內(nèi)同一日光燈下觀察大鼠舌象，用數(shù)碼相機并配合標(biāo)準(zhǔn)色卡拍照。應(yīng)用Photoshop 5.0軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色卡對所有照片進行校正，然后分析計算舌色的校正紅色值（R）、校正綠色值（G）、校正藍(lán)色值（B）。校正R值＝（標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)R值-標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)黑色值）×（舌象R值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）/（標(biāo)準(zhǔn)色卡實際R值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）。校正G值＝（標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)G值-標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)黑色值）×（舌象G值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）/（標(biāo)準(zhǔn)色卡實際G值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）。校正B值＝（標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)B值-標(biāo)準(zhǔn)色卡標(biāo)準(zhǔn)黑色值）×（舌象B值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）/（標(biāo)準(zhǔn)色卡實際B值-標(biāo)準(zhǔn)色卡實際黑色值）。舌背面舌下脈絡(luò)顯色長短分級計分標(biāo)準(zhǔn)［16]如下：舌下脈絡(luò)色澤紅潤，顯色約1/3舌體長計0分；舌下脈絡(luò)色澤紫暗，顯色大于1/3小于1/2舌體長計1分；舌下脈絡(luò)色澤紫暗，顯色約1/2舌體長計2分；舌下脈絡(luò)色澤紫黑，血管明顯增粗，顯色約2/3舌體長計3分。

1.7 腦梗死體積測算 術(shù)后24 h，觀察舌象、神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)束后，大鼠斷頭取腦，-20℃冰箱冷凍10～15 min，作均勻冠狀切片 6片（厚約 2 mm），用 2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37 ℃染色 13 min。 未缺血腦組織顏色為玫瑰紅色，缺血區(qū)變白色。數(shù)碼相機拍照，輸入電腦，用Image J圖像分析軟件計算腦片的梗死面積。分析計算每一腦片正常側(cè)及缺血側(cè)腦半球TTC 染紅（未缺血區(qū)）的面積，參照文獻的方法［19]，將兩者相減得到校正后的缺血面積，以消除腦水腫對梗死體積的影響。然后將每一腦片的缺血面積乘以腦片厚度，再將各腦片數(shù)值相加，得到全腦梗死體積的近似值，最后除以正常側(cè)腦半球體積，得到梗死體積百分比。梗死體積百分?jǐn)?shù)計算公式為（左側(cè)未梗面積之和-右側(cè)未梗面積之和）/左側(cè)未梗面積之和×100%

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗后進行方差分析，統(tǒng)計分析工具為SPSS 17.0軟件包，計量資料以 （±s）表示。相關(guān)性分析也采用SPSS17.0軟件包進行pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色變化與梗死灶體積的相關(guān)性 見圖1～圖3。采用SPSS軟件分別分析缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色與TTC染色梗死灶大小的相關(guān)性，缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色的校正R值、校正G值、校正B值與TTC染色腦梗死體積均密切相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。 缺血性中風(fēng)大鼠舌下脈絡(luò)與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 缺血性中風(fēng)大鼠舌色的校正R值與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性

圖2 缺血性中風(fēng)大鼠舌色的校正G值與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性

圖3 缺血性中風(fēng)大鼠舌色的校正B值與TTC染色腦梗死體積的相關(guān)性

2.2 各組大鼠腹面舌色的變化 見圖4。假手術(shù)組大鼠舌色淡紅，缺血性中風(fēng)模型組大鼠舌色偏暗，丁苯酞注射液組大鼠舌色改善明顯，丹紅注射液組大鼠的舌色也明顯得到改善。

圖4 各組大鼠腹面舌色的變化

2.3 各組大鼠舌色校正R、G、B值的比較 見表1。舌色分析結(jié)果顯示，缺血性中風(fēng)大鼠模型組舌色的校正紅色值（R值）、校正綠色值（G值）、校正藍(lán)色值（B值）均顯著低于假手術(shù)組大鼠（均P＜0.01）。丁苯酞組大鼠舌色校正R、G、B值顯著高于模型組（分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）。 丹紅注射液組大鼠舌色校正 R、G、B值顯著高于模型組，趨向正常水平（分別為P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）。丹紅注射液組與丁苯酞組大鼠的舌色校正R、G、B值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 各組大鼠舌色的校正R、G、B值比較（±s）

表1 各組大鼠舌色的校正R、G、B值比較（±s）

與缺血性中風(fēng)模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01。 下同

組 別 n 校正B值校正R值 校正G值假手術(shù)組 5 145.9±13.6缺血性中風(fēng)模型組 5 97.1±1.8△△丹紅注射液組 5 132.6±14.0*201.8±12.0 114.9±11.2 159.5±10.2△△ 82.4±10.9△△188.3±11.0** 104.6±17.5*丁苯酞注射液組 5 119.8±8.0*181.7±10.0** 99.8±7.1*

2.4 各組大鼠背面舌象的變化 見圖5，表2。假手術(shù)組大鼠舌下脈絡(luò)色澤紅潤，顯色小于1/3舌體長。模型組大鼠舌下脈絡(luò)色澤紫暗，有的血管明顯增粗，顯色大于1/3舌體長，最長約2/3舌體長。丁苯酞注射液組大鼠舌下脈絡(luò)色澤較模型組明顯改善，顯色長度縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），趨向假手術(shù)組。丹紅注射液組大鼠舌下脈絡(luò)色澤較模型組改善，顯色長度縮短，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），也趨向假手術(shù)組。丹紅注射液組與丁苯酞注射液組大鼠的舌下脈絡(luò)評分無明顯差異（P＞0.05）。

圖5 缺血性中風(fēng)大鼠背面舌象圖

表2 各組大鼠舌下脈絡(luò)評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠舌下脈絡(luò)評分比較（分，±s）

組 別 n 舌下脈絡(luò)評分假手術(shù)組 5缺血性中風(fēng)模型組 5丹紅注射液組 5 0 2.40±0.55 1.20±0.45**丁苯酞注射液組 50.80±0.45**

2.5 缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較 見表3。與缺血性中風(fēng)模型組大鼠比較，丁苯酞注射液組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯下降（P＜0.05）。丹紅注射液組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分也明顯下降（P＜0.05）。丹紅注射液組與丁苯酞注射液組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

組 別 n 神經(jīng)行為學(xué)評分假手術(shù)組 5缺血性中風(fēng)模型組 5丹紅注射液組 5 0 2.20±0.45 1.40±0.55*丁苯酞注射液組 51.20±0.45*

2.6 各組大鼠腦梗死體積比較 見表4。假手術(shù)組大鼠的大腦TTC染色無梗死灶，缺血性中風(fēng)模型組大鼠大腦TTC染色可見明顯梗死灶，丁苯酞組大鼠的腦梗死得到明顯改善，梗死灶明顯縮?。≒＜0.01）。丹紅注射液組大鼠的腦梗死得到明顯改善，梗死灶縮?。≒＜0.01）。丹紅注射液組與丁苯酞組大鼠的腦梗死體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

表4 各組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

組 別 n 腦梗死體積假手術(shù)組 5缺血性中風(fēng)模型組 5丹紅注射液組 5 0 43.54±1.89 13.60±0.41**丁苯酞注射液組 58.15±0.18**

3 討 論

缺血性中風(fēng)作為一種中老年人常見的急癥，具有高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高花費率，聯(lián)合中醫(yī)中藥常能獲得更好的療效并降低治療費用。血瘀證是缺血性中風(fēng)的主要證型。舌象作為臨床表征是血瘀證的重要依據(jù)。舌色的紅色值（R值）、綠色值（G值）、藍(lán)色值（B值）越大，則越接近于其代表的顏色。缺血性中風(fēng)大鼠舌色接近紫暗，校正R值、G值、B值均顯著低于假手術(shù)組大鼠（均P＜0.01）。我們觀察了缺血性中風(fēng)模型大鼠舌色校正R、G、B值與腦梗死體積的關(guān)系，結(jié)果顯示均密切相關(guān)。證實了缺血性中風(fēng)模型大鼠血瘀證相關(guān)舌象具有實際應(yīng)用價值，適合用來觀察丹紅注射液對其血瘀證相關(guān)舌象的干預(yù)研究。也為其他活血化瘀藥的療效觀察提供模型和方法。本文證實了丹紅注射液對缺血性中風(fēng)大鼠血瘀證相關(guān)舌象具有明顯的改善作用，且舌象與腦梗死體積均密切相關(guān)，這也為臨證辨證施治提供了科學(xué)依據(jù)。

目前有關(guān)大鼠舌象的研究，宏觀和微觀觀察方面均取得了一定的進展，利用了計算機軟件等輔助手段，在技術(shù)層面觀察方式已經(jīng)比較完善。特別是應(yīng)用數(shù)碼相機拍攝大鼠舌象后，通過Image-proplus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件分析大鼠舌色，可以更客觀地觀察舌色的改變。但是病理狀態(tài)舌象僅通過經(jīng)驗判斷，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［19]。為了客觀、定量地評價缺血性中風(fēng)模型大鼠的舌象變化，我們在舌象采集過程中也注意在當(dāng)日同一時間點、同一地點、同一日光燈下進行拍攝，以避免光線不同的影響。在采集過程中，我們應(yīng)用了標(biāo)準(zhǔn)色卡，在一定程度上排除了拍攝角度、距離對舌象的影響［20]。我們還采用了舌色校正公式進行計算以獲得校正R值、校正G值和校正B值，且驗證了其與腦梗死體積均相關(guān)，因此我們的舌象采集和分析方法是比較客觀和可靠的。本文為中醫(yī)證候動物模型評價提供了依據(jù)，為中醫(yī)望診內(nèi)容的血瘀舌象的客觀化、定量化提供了一種較為可靠的方法。

本文采用的是改良Longa法制備的缺血性中風(fēng)大鼠模型，通過線栓法入顱導(dǎo)致大腦中動脈（MCA）血流的阻斷，造成了確定可控的缺血性腦梗死灶，能很好地模仿缺血性中風(fēng)患者的病理狀態(tài)，適合觀察藥物的作用及其機制。我們在前期的實驗和PET檢查均發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能有效治療缺血性中風(fēng)大鼠［5-6]，ELISA結(jié)果顯示丹紅注射液能提高6-keto-PGF1α水平、SOD活性、血漿t-PA水平，同時降低MDA和PAI活性，降低TNF-α和IL-1β表達，免疫組化結(jié)果顯示丹紅注射液能促進Bcl-2表達，降低Bax表達，促進神經(jīng)元成熟，NeuN表達增加，促進神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達GFAP，促進vWF表達，降低GLUT1表達。

在此基礎(chǔ)上，本文觀察到與缺血性中風(fēng)模型組大鼠比較，丹紅注射液組大鼠舌色校正R、校正G、校正B值顯著高于模型組，說明丹紅注射液可以顯著改善大鼠舌色，使其更接近于假手術(shù)大鼠。丹紅注射液組舌背面舌下脈絡(luò)色澤較模型組改善，顯色長度縮短。這些從舌象的角度說明了丹紅注射液具有活血化瘀的作用。丹紅注射液組神經(jīng)行為學(xué)評分也明顯下降，腦梗死灶縮?。≒＜0.05或P＜0.01）。丹紅注射液組與陽性對照丁苯酞注射液組的各指標(biāo)比較無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），這說明DHI與丁苯酞注射液的療效相當(dāng)。至于缺血性中風(fēng)大鼠舌下脈絡(luò)與TTC染色梗死體積的相關(guān)性分析無顯著性差異（P＝0.051）。這可能與舌下脈絡(luò)評分較為主觀，且動物數(shù)較少有關(guān)。我們將進一步擴大動物數(shù)，再選擇更為客觀的舌部組織的分子學(xué)指標(biāo)，深入研究丹紅注射液對缺血性中風(fēng)大鼠血瘀相關(guān)舌象的改善作用。