泰山4種優(yōu)勢(shì)造林樹(shù)種葉片凋落物分解對(duì)凋落物內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

路 穎,李 坤,梁 強(qiáng),李傳榮,張彩虹,*

1 國(guó)家林業(yè)局泰山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站,泰安 271018 2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,泰安 271018

凋落物分解是森林土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的主要來(lái)源之一,為微生物提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)源[1-2]。不同的森林凋落物可以通過(guò)形成不同的微環(huán)境直接影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成,從而影響其分解速率[3-5]。目前關(guān)于凋落物分解過(guò)程中微生物群落變化的研究主要是關(guān)注土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)[6-7],而對(duì)分解過(guò)程中凋落物內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究涉及較少[8]。細(xì)菌作為微生物中數(shù)量最大、種類最多的一類,具有含氮量高、含碳量低的特點(diǎn),對(duì)土壤養(yǎng)分的形成與分解有促進(jìn)作用[9-11]。研究認(rèn)為細(xì)菌在凋落物分解中的貢獻(xiàn)被低估,當(dāng)分解到后期時(shí),凋落物養(yǎng)分降低,細(xì)菌群落生物量升高[12-13]。目前細(xì)菌結(jié)構(gòu)及多樣性研究逐漸受到關(guān)注[14-15]。

長(zhǎng)期以來(lái),土壤微生物研究受技術(shù)手段的限制,無(wú)法真實(shí)地、更全面地反映土壤微生物群落多樣性[16],特別是在凋落物分解過(guò)程中[17]。新一代高通量測(cè)序技術(shù)在整體水平上破譯了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),將有助于獲得土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的更全面而完整的信息,已經(jīng)成為研究土壤微生物多樣性的常規(guī)手段[6,18]。目前,應(yīng)用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)研究凋落物內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)方面的內(nèi)容仍然較少。

泰山森林生態(tài)系統(tǒng)作為暖溫帶落葉森林生態(tài)系統(tǒng)的代表,已經(jīng)受到研究者的關(guān)注。該系統(tǒng)樹(shù)種組成單一,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,往往是由一種喬木組成的純林,林地內(nèi)凋落物層稀薄導(dǎo)致土壤肥力較低,不利于森林群落長(zhǎng)期持續(xù)地發(fā)展。這就要求深入了解林內(nèi)養(yǎng)分的循環(huán)情況。因此,本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4—V5區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序,分析了泰山四種優(yōu)勢(shì)造林樹(shù)種葉片凋落物分解對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響,為研究葉凋落物分解的微生物控制機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 研究材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點(diǎn)位于泰山森林生態(tài)系統(tǒng)觀測(cè)研究站(117°05′—117°09′E,36°17′—36°20′N(xiāo)),本站位于山東省藥鄉(xiāng)林場(chǎng)。屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候,年均氣溫18.5℃,年均降水量758 mm,主要集中在6—9月。中低山丘陵地貌,主要土壤類型為中性至酸性棕壤,土層較薄,厚度為20—30 cm。地帶性植被類型為暖溫帶落葉闊葉林,目前森林覆蓋率達(dá)81.57%,植被覆蓋率達(dá)90%以上。主要森林類型為油松(Pinustabulaeformis)、側(cè)柏(Platycladusorientalis)、赤松(Pinusdensiflora)、刺槐(Robiniapseucdoacacia)、麻櫟(Quercusacutissima)的人工林。

1.2 研究方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品分析

樣品收集：本項(xiàng)目采用泰山站附近4種主要樹(shù)種的葉片凋落物作為分解的材料。為了保證后期分解試驗(yàn)的順利開(kāi)展,在試驗(yàn)開(kāi)始之前收集刺槐(RP)、麻櫟(QA)、赤松(PD)和油松(PT)的葉凋落物。葉凋落物收集采用林內(nèi)收集筐的方式,于2015年9—10月在各物種的純林內(nèi)布設(shè)10個(gè)凋落物收集筐,并使收集筐分布廣泛來(lái)減少誤差,將收集到的同種凋落物混合均勻,以備使用。將收集到的葉凋落物置于室內(nèi)風(fēng)干備用。取小部分樣品在65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重,計(jì)算分解底物風(fēng)干/烘干換算系數(shù)比(計(jì)算含水量)。并測(cè)定初始樣品的C、N、P和木質(zhì)素含量。

試驗(yàn)布設(shè)及取樣：采用通用的凋落物袋的方法,根據(jù)分解時(shí)間的長(zhǎng)短以及所測(cè)指標(biāo)的用量,每個(gè)凋落物袋中裝入風(fēng)干的樣品6 g,并根據(jù)樣品量選擇凋落物袋的大小為15 cm×15 cm(網(wǎng)孔大小為1 mm×1 mm)[19]。2016年7月,采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將分解袋布設(shè)于6個(gè)重復(fù)的試驗(yàn)區(qū)內(nèi),小區(qū)大小為10 m×10 m,相鄰小區(qū)設(shè)置5 m×5 m的隔離帶,每個(gè)小區(qū)包含所有4個(gè)處理。將樣品置于土壤表層,先清理掉土壤表面的凋落物,然后用自制U型釘將凋落物分解袋固定于土壤表面。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為一年,2017年7月取樣。取樣時(shí),每個(gè)小區(qū)中每種處理取1袋,清除凋落物表面粘附的土壤和長(zhǎng)入的雜草。其中3袋重復(fù)樣品標(biāo)記后立即存于液氮中,用于測(cè)定微生物細(xì)菌群落。樣品DNA的提取以及細(xì)菌多樣性數(shù)據(jù)的分析由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。另外的3袋重復(fù)樣品在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)去除其中的雜質(zhì),65℃烘干至恒重,然后稱重,并測(cè)定其灰分含量,用于矯正干重。同時(shí)測(cè)定樣品的C、N、P和木質(zhì)素含量。

干重剩余率用Olson[20]負(fù)指數(shù)衰減模型y=ae-kt進(jìn)行擬合。式中,y為干重殘留率,a為修正參數(shù),k為分解系數(shù),t為分解時(shí)間。凋落物中C、N含量采用元素分析儀(Vario Max CN),P含量采用鉬銻抗比色法,木質(zhì)素含量根據(jù)中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 2677.8—1994; GB/T 10337—2008),采用逐步提取和重量分析法。簡(jiǎn)而言之,樣品用苯酚乙醇溶液浸提后,用72%濃硫酸溶液水解,然后將懸浮物過(guò)濾掉,用蒸餾水漂洗殘余物質(zhì)直至在BaCl2溶液中澄清。

1.2.2樣品DNA提取和測(cè)序

樣本基因組DNA的提取采用CTAB方法,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和濃度。16S rDNA V4—V5 區(qū)引物 515F/907R,將 Bar-code 序列通常加在515F的5′末端,引物如下：515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；907R：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′。PCR 擴(kuò)增體系：2*taq PCR mix：25 μL；Primer F(10 μmol/L)：1 μL；Primer FR(10 μmol/L)：1 μL；gDNA：2.5 μL；H2O：8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；34個(gè)循環(huán)包括(94℃,1 min；57℃,45 s；72℃,1 min)；72℃,10 min；16℃,5 min。New England Biolabs 公司的Phusion? High-Fidelity PCR MasterMix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。委托北京諾禾致源測(cè)序公司(Novegene,China) 進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類,選擇97% 相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分析。利用Qiime軟件(Version 1.35.1)計(jì)算樣品的α多樣性指數(shù),反映不同樹(shù)種葉片凋落物分解過(guò)程中細(xì)菌群落的豐度和多樣性,包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Coverage指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。利用R軟件(Version2.15.3)進(jìn)行葉片分解細(xì)菌群落的NMDS分析。用Anosim方法對(duì)組間群落相似度進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)[21]。不同葉片凋落物初始化學(xué)元素、分解速率以及主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群相對(duì)豐度、細(xì)菌多樣性之間的差異采用單因素方差分析。葉片凋落物性狀和細(xì)菌群落的NMDS用Canoco 5.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同物種葉凋落物分解過(guò)程的差異

從表1可以看出,選擇的4種葉凋落物初始化學(xué)性質(zhì)之間存在顯著差異。C含量表現(xiàn)出針葉樹(shù)種(赤松PD、油松PT)顯著高于闊葉樹(shù)種(刺槐RP、麻櫟QA)(P<0.05)；N含量、N/P比麻櫟樹(shù)種顯著低于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05),而C/N比麻櫟顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05)；木質(zhì)素含量和木質(zhì)素/N比赤松樹(shù)種均顯著低于其他樹(shù)種(P<0.05),其中油松木質(zhì)素含量最高,顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05),麻櫟的木質(zhì)素/N比最高,顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05)。

表1 葉片凋落物初始化學(xué)元素含量的差異

RP：刺槐,Robiniapseucdoacacia；QA：麻櫟,Quercusacutissima；PD：赤松,Pinusdensiflora；PT：油松,Pinustabulaeformis；同列不同的小寫(xiě)字母代表不同處理之間在0.05水平差異顯著

對(duì)4種樹(shù)種葉凋落物分解一年后化學(xué)元素含量與初始化學(xué)元素含量進(jìn)行對(duì)比分析,結(jié)果如圖1所示。選擇的4種葉凋落物分解一年后化學(xué)元素含量與初始化學(xué)元素相比均存在顯著差異。C含量均顯著降低(P<0.05)；N含量除赤松升高不顯著之外,其他3個(gè)樹(shù)種均顯著升高(P<0.05)；P含量除刺槐升高不顯著之外,其他3個(gè)樹(shù)種均顯著升高(P<0.05)；木質(zhì)素含量除赤松降低不顯著之外,均表現(xiàn)為顯著降低(P<0.05)。

圖1 4種葉凋落物分解一年后化學(xué)元素含量與初始化學(xué)元素差異Fig.1 Differences in element content between initial and after decomposing in one year for four leaf litterRP：刺槐,Robinia pseucdoacacia；QA：麻櫟,Quercus acutissima；PD：赤松,Pinus densiflora；PT：油松,Pinus tabulaeformis；不同的小寫(xiě)字母代表不同處理之間在0.05水平差異顯著

泰山4種主要優(yōu)勢(shì)造林樹(shù)種葉凋落物分解速率之間差異顯著(P<0.05)。圖2可見(jiàn),刺槐分解速率顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05),而麻櫟、油松、赤松之間差異不顯著(P>0.05),分解快慢表現(xiàn)為刺槐>赤松>油松>麻櫟。

圖2 4種植物葉片凋落物分解速率k之間的差異Fig.2 Difference in decomposition rate k between four plants

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的優(yōu)化分析

利用Qiime軟件做Rarefaction 分析,制作稀釋曲線(圖3)。由圖3可見(jiàn),隨著測(cè)序序列數(shù)目的增加,12個(gè)測(cè)序樣本的曲線基本趨向平穩(wěn),表明測(cè)序趨于飽和,測(cè)得的數(shù)據(jù)量漸近合理,能較真實(shí)地反應(yīng)這12個(gè)樣品中的微生物群落,結(jié)合表4中的樣品覆蓋率,說(shuō)明測(cè)序結(jié)果中包含了大多數(shù)微生物類群,更多的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)新的OUT貢獻(xiàn)率較小,基本可以反映葉凋落物分解過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成,但可能仍有少量微生物種類未被發(fā)現(xiàn)。

圖3 稀釋曲線Fig.3 Rank AbundanceRP：刺槐,Robinia pseucdoacacia；QA：麻櫟,Quercus acutissima；PD：赤松,Pinus densiflora；PT：油松,Pinus tabulaeformis；數(shù)字1.2.3表示同一處理的3個(gè)重復(fù)

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

高通量測(cè)序的結(jié)果顯示所有樣品一共獲得643440條有效序列,其中最少序列為37636條,最多序列為71004條(平均序列條數(shù)為53620條)。這些序列分屬于35門(mén),92綱,121目,246科,410屬,206種。根據(jù)分類學(xué)注釋結(jié)果,分別在門(mén)和綱水平下進(jìn)行樣品物種豐度的統(tǒng)計(jì)分析。從圖4可見(jiàn),在門(mén)水平上,葉片凋落物分解中細(xì)菌類群多集中于變形菌門(mén)(58.8%,Proteobacteria)、放線菌門(mén)(15.3%,Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(11.9%,Bacteroidetes)、酸桿菌門(mén)(3.7%,Acidobacteria),占總序列的89.7%,其中變形菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在綱水平上,平均相對(duì)豐度大于5%的類群為α-變形菌綱(37.2%,Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(10.6%,Betaproteobacteria)、不明放線菌綱(11.1%,unidentified-Actinobacteria)、鞘脂桿菌綱(9.8%,Sphingobacteria)、γ-變形菌綱(8.6%,Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(5.6%,Deltaproteobacteria)。

圖4 葉片分解對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落相對(duì)豐度的影響Fig.4 The relative abundance of dominant bacterial communities after one year of leaf litter

細(xì)菌群落的NMDS分析結(jié)果顯示(圖5),Stress為0.084,說(shuō)明NMDS可以準(zhǔn)確反映樣品間的差異程度。樣品的空間差異明顯,4個(gè)樹(shù)種之間油松和赤松表現(xiàn)出較高的相似性,聚類位置較為接近。即除油松和赤松間差異較小外,其他樹(shù)種間差異程度均較大。用Anosim方法對(duì)組間群落相似度進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果也顯示(表2),除油松和赤松外,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均存在顯著差異,與圖5結(jié)果一致。

表2 組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異Anosim顯著性檢驗(yàn)

R值介于(-1,1)之間,R-value大于0,說(shuō)明組間差異顯著。R-value小于0,說(shuō)明組內(nèi)差異大于組間差異

圖5 葉片分解細(xì)菌群落的非度量多維尺度(NMDS)分析 Fig.5 Non-Metric Multi-Dimensional Scaling (NMDS) analysis of bacterial community in leaf decomposition

由圖6可知,在門(mén)的水平上,刺槐葉凋落物分解一年后相對(duì)豐度最大的變形菌門(mén)顯著低于麻櫟和赤松(P<0.05),而放線菌門(mén)顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05)；麻櫟葉凋落物分解中變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05),而擬桿菌門(mén)顯著低于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05)；赤松和油松在4個(gè)門(mén)中差異均不顯著(P>0.05)。在綱的水平上,刺槐葉凋落物分解中不明放線菌綱顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05),麻櫟葉凋落物分解的鞘脂桿菌綱的相對(duì)豐度顯著低于其他3個(gè)樹(shù)種(P<0.05)。

圖6 4種處理之間主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群相對(duì)豐度的差異Fig.6 Differences in relative abundances of major bacterial dominant groups between the four treatments

群落結(jié)構(gòu)的變化主要是由優(yōu)勢(shì)種的變化引起的,我們選擇4個(gè)處理細(xì)菌群落中相對(duì)豐度前5位的優(yōu)勢(shì)種進(jìn)行進(jìn)一步分析,結(jié)果如表3所示。由表可知,Bradyrhizobiumelkanii和Luteibacterrhizovicinus在4個(gè)處理中都為優(yōu)勢(shì)種；Sphingomonassoli和Streptomycesprunicolor是刺槐處理特有的優(yōu)勢(shì)種；Labrysmiyagiensis和Sphingomonassanxanigenens是麻櫟特有的優(yōu)勢(shì)種；油松和赤松的優(yōu)勢(shì)種較為相似,其中Chitinophagapinensis是赤松所特有,而Cercisgigantea是油松所特有。

表3 4種葉凋落物細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)種的相對(duì)豐度差異

2.4 葉片凋落物分解對(duì)細(xì)菌多樣性的影響

從表4可以看出,葉凋落物分解一年后微生物基因序列的覆蓋率均達(dá)到96.8%以上,說(shuō)明所測(cè)定序列可以充分反映樣本細(xì)菌群落的種類和結(jié)構(gòu)。4個(gè)樹(shù)種葉凋落物分解一年后細(xì)菌豐富度(OUT、觀測(cè)到的物種數(shù)、Chao1和ACE)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性(PD)之間有顯著差異(P0.05),且闊葉樹(shù)種刺槐和麻櫟高于針葉樹(shù)種赤松和油松。菌群多樣性香濃維納指數(shù)麻櫟最低,顯著低于其他3個(gè)樹(shù)種(P0.05),表現(xiàn)為刺槐>赤松>油松>麻櫟。

表4 葉凋落物分解一年后細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)分析

2.5 葉片凋落物性狀與細(xì)菌群落N(xiāo)MDS分析

利用Canoco5.0軟件對(duì)葉片凋落物性狀和細(xì)菌群落進(jìn)行NMDS分析(圖7),結(jié)果顯示,Stress值為0.0005,說(shuō)明本分析具有很好的代表性,葉片凋落物性狀與細(xì)菌群落之間的影響特別適合用NMDS進(jìn)行評(píng)估。在所研究的21個(gè)因子中, 根據(jù)NMDS分析結(jié)果顯示, 分解速率k值與初始C/N比相關(guān)性最大,其次是與初始的木質(zhì)素/N比和菌群多樣性香濃維納指數(shù)；菌群多樣性香濃維納指數(shù)與葉片凋落物初始木質(zhì)素/N比相關(guān)性最大,其次是初始木質(zhì)素含量和C/N比；細(xì)菌群落覆蓋率及菌群豐度指數(shù)(Chao1、ACE)與分解一年后的N含量、木質(zhì)素含量以及C含量相關(guān)性較大；細(xì)菌群落物種數(shù)與分解一年后N含量、N/P比以及P含量相關(guān)性較大。

圖7 葉片凋落物性狀和細(xì)菌群落的非度量多維尺度(NMDS)分析Fig.7 Non-Metric Multi-Dimensional Scaling (NMDS) analysis of leaf litter characters and bacterial communitiesC：總碳含量,Total carbon；N：總氮含量,Total nitrogen；P：總磷含量,Total phosphorus；C/N：碳氮比,Ratio of carbon: nitrogen；N/P：氮磷比,Ratio of nitrogen: phosphorus；Lignin：木質(zhì)素含量,Lignin；Lignin/N:木質(zhì)素氮比,Ratio of lignin: nitrogen；OC：初始總碳含量,Original total carbon；ON：初始總氮含量,Original total nitrogen；OP：初始總磷含量,Original total phosphorus；OC/ON：初始碳氮比,Ratio of original carbon∶original nitrogen；ON/OP：初始氮磷比,Ratio of original nitrogen∶original phosphorus；OLignin：初始木質(zhì)素含量,Original lignin；OLignin/ON:初始木質(zhì)素氮比,Ratio of Original lignin∶Original nitrogen；Species：物種數(shù),Observed-species；Coverage：覆蓋率,Coverage；Chao1：Chao1指數(shù),Chao1 index；ACE：ACE指數(shù),ACE index；PD：PD指數(shù),PD index；Shannon：香濃維納指數(shù),Shannon-Wiener index；Simpson：Simpson指數(shù),Simpson index；k：分解速率,decomposition rate k

3 討論

3.1 不同造林樹(shù)種葉片凋落物化學(xué)元素含量的差異

凋落物性質(zhì)與物種密切相關(guān)[22]。選擇的4種葉片凋落物初始化學(xué)性質(zhì)之間存在顯著差異(表1)。研究表明,凋落物中C含量越低,分解速率越快[19]。本研究中C含量表現(xiàn)出針葉樹(shù)種(赤松PD、油松PT)顯著高于闊葉樹(shù)種(刺槐RP、麻櫟QA),其中刺槐的C含量最低,這可能是刺槐分解較快的原因。大量的研究發(fā)現(xiàn),凋落物初始N含量以及與N相關(guān)的底物質(zhì)量指標(biāo)和凋落物分解速率有很好的相關(guān)關(guān)系,C/N比和木質(zhì)素/N比等指標(biāo)常被用于預(yù)測(cè)凋落物的分解速率[23-24]。本研究結(jié)果顯示,N含量、N/P比麻櫟樹(shù)種顯著低于其他3個(gè)樹(shù)種,而C/N比、木質(zhì)素/N比麻櫟顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種,這也可能是麻櫟分解較慢的原因。由于N、P有效性在不同生態(tài)系統(tǒng)間的差異,因此有些研究者認(rèn)為N和P對(duì)凋落物分解限制的相對(duì)重要性也不同,當(dāng)N/P比低時(shí)受N限制,當(dāng)N/P比高時(shí)受P限制(通常認(rèn)為N/P比<14時(shí)受N限制,N/P比>16時(shí)受P限制,當(dāng)N/P比在14和16 之間受到N、P的共同限制)[25]。本研究結(jié)果N/P比均<14,所以在本研究區(qū)域凋落物分解受N含量限制較多。

選擇的4種葉凋落物分解一年后化學(xué)元素含量與初始化學(xué)元素相比均存在顯著差異(圖1)。結(jié)果顯示,4種樹(shù)種葉片凋落物C含量均顯著降低,與趙谷風(fēng)等[26]對(duì)青岡常綠闊葉林凋落物分解過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)元素動(dòng)態(tài)研究結(jié)果一致。葉片凋落物分解一年后,4種葉片凋落物中N、P含量總體均呈增大趨勢(shì),與葛曉敏[27]、施昀希[28]等研究的結(jié)果相吻合。N和P在含量上的增加都是十分普遍的。N含量的提高與微生物固N(yùn)、降水及菌根的吸收等作用有關(guān)[29]。有研究表明,凋落物分解的初級(jí)階段經(jīng)常需要富集P,因?yàn)樾迈r凋落物中的P養(yǎng)分不足以維持分解者的生長(zhǎng),而凋落物分解速率常與P及其相聯(lián)系的凋落物質(zhì)量指標(biāo)顯著相關(guān)[3,30]。木質(zhì)素在凋落物分解過(guò)程中屬于難分解成分[19],在木質(zhì)素含量高(>25%) 的凋落物中,木質(zhì)素是預(yù)測(cè)凋落物分解的較好指標(biāo)[31]。本研究結(jié)果顯示,木質(zhì)素含量除赤松降低不顯著之外,均表現(xiàn)為顯著降低。覃揚(yáng)澮等[32]對(duì)漓江流域巖溶區(qū)檵木群落不同恢復(fù)階段凋落物分解初期動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)一年分解后,喬林階段木質(zhì)素含量較初始含量有所減少,這與本研究結(jié)果一致。

3.2 不同造林樹(shù)種葉片凋落物分解一年后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與群落多樣性的差異

前人研究認(rèn)為細(xì)菌在分解后期起主要作用[13,33]。葉凋落物細(xì)菌群落N(xiāo)MDS分析(圖5)與Anosim組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著性檢驗(yàn)(表2)均顯示,除油松和赤松外,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均存在顯著差異。分解一年后,主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)是變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和酸桿菌門(mén)(圖4)。朱平等[5]在青藏高原北麓河流域分析草甸、草原和荒漠草原土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異發(fā)現(xiàn)主要優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)4個(gè)門(mén)類,與本研究結(jié)果一致。許多研究也表明酸桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)細(xì)菌是不同植被土壤中的優(yōu)勢(shì)群落[11,34]。例如翟婉璐、丁新景等研究表明變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和放線菌門(mén)分別是林地和黃河三角洲人工林土壤中主要優(yōu)勢(shì)群落[15,35]。這應(yīng)該與酸桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)3門(mén)細(xì)菌的生態(tài)幅有關(guān),它們的生態(tài)幅較寬因此受環(huán)境影響也較小[36-37]。變形菌門(mén)細(xì)菌是土壤環(huán)境中的一大類細(xì)菌群落,部分變形菌門(mén)細(xì)菌能夠利用有機(jī)物分解產(chǎn)生的氨氣、甲烷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝活動(dòng)[38]。本研究中,葉片凋落物分解一年后細(xì)菌相對(duì)豐度最大的是變形菌門(mén),被視為樹(shù)葉分解轉(zhuǎn)化的主要功能細(xì)菌,該研究結(jié)果與先前研究結(jié)果相一致[39]。放線菌大部分屬于腐生菌,Crawford等[40]的研究表明放線菌門(mén)的部分細(xì)菌種群能夠產(chǎn)生分解木質(zhì)素的酶,具有分解木質(zhì)素和纖維素的能力,起到分解植物有機(jī)殘?bào)w的作用。分解后期葉片凋落物殘留主要是一些難分解的木質(zhì)素等,刺槐的放線菌門(mén)相對(duì)豐度最大(圖6),這也可能是刺槐分解最快的主要原因。擬桿菌門(mén)的細(xì)菌能破壞復(fù)雜的生物大分子,因此其與木質(zhì)纖維素凋落物的分解相關(guān)[41]。本研究中,麻櫟中擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著低于其他3個(gè)樹(shù)種(圖6),這主要由于麻櫟初始木質(zhì)素含量以及木質(zhì)素/N比含量較低(表1),不利于擬桿菌門(mén)的生長(zhǎng)。有研究表明酸桿菌門(mén)細(xì)菌在不同pH土壤中相對(duì)豐度不同,在酸性土壤中豐度較高,堿性土壤中較低[42]。本研究樣地土壤pH值6.5左右[43],呈弱酸性,所以酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度較高。其中麻櫟中酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(圖6),而C含量也相對(duì)較低,這與前人研究略有差異[44]。這可能是因?yàn)榍叭搜芯康氖强扇苄杂袡C(jī)碳,而我們測(cè)得是凋落物內(nèi)全碳含量。Magill等[45]對(duì)森林土壤的研究表明,土壤中N含量的增加會(huì)使酸桿菌門(mén)的多樣性增加。而本研究結(jié)果顯示麻櫟的N含量最低而酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度卻最大,與前人結(jié)果相反。這可能與研究條件不同有關(guān),我們研究的是凋落物內(nèi)N含量而不是土壤中N含量。

在綱的水平上,葉片凋落物分解一年后,α-變形菌綱、β-變形菌綱、不明放線菌綱、鞘脂桿菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱相對(duì)豐度較高,其中α-變形菌綱的相對(duì)豐度最大(圖4)。α-變形菌包括大量的參與C、N循環(huán)的細(xì)菌、這些細(xì)菌的增加對(duì)生態(tài)系統(tǒng)氮的穩(wěn)定性和土壤能量的平衡起到重要的作用,對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要意義[35]。研究結(jié)果顯示,刺槐分解中不明放線菌綱顯著高于其他3個(gè)樹(shù)種(圖6,P<0.05),這與前面放線菌門(mén)的結(jié)果一致(圖4)。麻櫟凋落物葉分解的鞘脂桿菌綱的相對(duì)豐度顯著低于其他3個(gè)樹(shù)種(圖6,P<0.05)。鞘脂桿菌綱有利于凋落物中纖維素的降解[46],這可能是麻櫟分解最慢的原因(圖2)。

在種的水平上,Bradyrhizobiumelkanii和Luteibacterrhizovicinus在4個(gè)樹(shù)種中都為優(yōu)勢(shì)種(表3)。埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)是主要的固氮菌種,C/N比是調(diào)控地上植物群落與固氮微生物群落動(dòng)態(tài)的關(guān)鍵因子[47]。本研究結(jié)果也顯示在4個(gè)樹(shù)種中埃氏慢生根瘤菌的相對(duì)豐度與葉片凋落物初始C/N比相一致。Luteibacterrhizovicinus屬于黃單胞菌科(Xanthomonadaceae),是主要產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株[48],有助于葉片凋落物的分解。除此之外,每個(gè)樹(shù)種也都有自己所特有的優(yōu)勢(shì)種(表3)。不同樹(shù)種中優(yōu)勢(shì)種的差異也可能是造成物種間群落結(jié)構(gòu)差異的一個(gè)重要原因。四種葉片凋落物分解一年后,細(xì)菌豐富度(OUT、觀測(cè)到的物種數(shù)、Chao1、ACE)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性(PD)之間存在差異,且闊葉樹(shù)種刺槐和麻櫟高于針葉樹(shù)種赤松和油松(表4)。前人對(duì)葉片凋落物分解的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)針葉凋落物內(nèi)細(xì)菌多樣性低于闊葉凋落物[8],與本研究結(jié)果一致。不同的樹(shù)種凋落物中含有不同的碳源和氮源,驅(qū)使土壤微生物集群定向進(jìn)化,進(jìn)而改變土壤肥力,闊葉林之間微生物群落結(jié)構(gòu)組成相近[39]。其原因可能是闊葉林樹(shù)葉分解引入土壤中碳含量比針葉林高,且闊葉林中包含更為豐富的碳源種類,導(dǎo)致了闊葉林下土壤微生物多樣性高于針葉林[49]。

3.3 細(xì)菌群落多樣性與葉片凋落物化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

細(xì)菌在凋落物分解上的貢獻(xiàn)受到凋落物化學(xué)組成的影響[12]。菌群多樣性香濃維納指數(shù)與葉片凋落物初始木質(zhì)素/N比相關(guān)性最大,其次是初始木質(zhì)素含量和C/N比(圖7)。前人大量研究也表明,細(xì)菌群落多樣性與分解底物初始化學(xué)性質(zhì)相關(guān),但結(jié)論并不一致[50]。Hawke和VMlance[51]認(rèn)為C/N比能夠調(diào)節(jié)土壤微生物繁衍和養(yǎng)分釋放之間的平衡。陳法霖等[6]通過(guò)研究凋落物分解過(guò)程中的土壤微生物群落發(fā)現(xiàn),細(xì)菌占微生物群落的比重與凋落物初始C/N比、木質(zhì)素/N比呈顯著負(fù)相關(guān)。一般來(lái)說(shuō),新鮮凋落物的C/N比高于微生物分解者,微生物需要從周?chē)h(huán)境(土壤或降水) 獲取養(yǎng)分來(lái)維持其自身的生長(zhǎng)需求[52]。細(xì)菌群落覆蓋率及菌群豐度指數(shù)(Chao1、ACE、PD)與分解一年后的N含量、木質(zhì)素含量以及C含量相關(guān)性較大；細(xì)菌群落物種數(shù)與分解一年后N含量、N/P比以及P含量相關(guān)性較大(圖7)。Zhao等[53]的研究發(fā)現(xiàn)分解過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到凋落物內(nèi)C含量的調(diào)節(jié),而凋落物N含量并不會(huì)影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。本結(jié)果顯示菌群多樣性與凋落物內(nèi)N含量有很大相關(guān)性,與其結(jié)果不一致。這可能是由于研究環(huán)境條件的差異,本研究關(guān)注的是葉片凋落物在森林中的分解,而該研究關(guān)注的是葉片在淡水中的分解。而且研究方法也不同,本研究結(jié)果是基于高通量測(cè)序,更能真實(shí)地、全面地反映微生物群落多樣性。Zhao等[44]認(rèn)為細(xì)菌豐度與磷濃度正相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落數(shù)與P含量相關(guān)性較大,與其結(jié)果一致。不過(guò)與N相比,人們對(duì)P與微生物結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系了解較少[54],應(yīng)該更進(jìn)一步的研究。

葉片凋落物性狀和細(xì)菌群落的NMDS分析結(jié)果也顯示(圖7),分解速率k值與菌群多樣性香濃維納指數(shù)有很大的相關(guān)性。這與前人研究結(jié)果一致[8,55]。此外,研究還表明分解速率k值與初始C/N比相關(guān)性最大,其次是與初始的木質(zhì)素/N比。通常C/N 比和木質(zhì)素/N比高的凋落物分解較慢[1],4種樹(shù)種中麻櫟的C/N比和木質(zhì)素/N比都最高,且分解最慢,與前人結(jié)果一致。在本研究區(qū)域泰山森林生態(tài)系統(tǒng)中,對(duì)于細(xì)菌群落多樣性和葉片凋落物化學(xué)性質(zhì)兩個(gè)因素來(lái)說(shuō),分解速率與凋落物化學(xué)性質(zhì)相關(guān)性更大一些。