東北草地野大麥對混合鹽堿脅迫的生理響應(yīng)及轉(zhuǎn)錄組分析

宋士偉，焦德志，楊允菲

（1. 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院 / 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 東北師范大學草地科學研究所 / 植被生態(tài)科學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024）

土壤鹽堿化現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)對生態(tài)環(huán)境影響較大的一個問題，我國近年來土地鹽堿化面積不斷增加，而我國東北部是鹽堿化土壤分布面積較大的地區(qū)之一，土地鹽堿化問題已經(jīng)對生態(tài)環(huán)境及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重威脅。松嫩平原是我國重要糧食及畜牧業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)地，其土壤類型總體上為鹽堿土，是我國東北部土壤鹽堿化較為嚴重的區(qū)域之一[1]，土壤鹽堿化對植被生長發(fā)育及畜牧業(yè)生產(chǎn)有巨大的負面影響。松嫩平原內(nèi)最主要的自然植被是羊草(Leymus chinensis)群落和草甸植物群落，鹽堿離子濃度的過度積累，原生植被會逐漸消失，取而代之的是一些鹽生植物群落[2]。20世紀50-90年代僅在吉林省西部地區(qū)的草原面積就因土壤鹽堿化等因素退化56.57%，嚴重制約當?shù)匦竽翗I(yè)及農(nóng)業(yè)的發(fā)展[3]。

扎龍濕地位于松嫩平原西北部，是以蘆葦(Phragmites australis)為主要植被的國際重要濕地[4]。但近年來，由于自然因素及人為因素干擾，大面積的蘆葦群落被更多的旱地所分割[5]，在一定區(qū)域內(nèi)形成以旱生植物為主的鹽堿化草地，部分區(qū)域出現(xiàn)明顯的鹽堿化現(xiàn)象。長期觀察發(fā)現(xiàn)，在鹽堿化草地或者較為明顯堿斑裸地邊緣有野大麥(Hordeum brevisubulatum)種群的集群分布。野大麥是多年生禾本科優(yōu)質(zhì)牧草，是小麥族中耐鹽性最強的物種之一，具有營養(yǎng)豐富、適口性好、牲畜喜食、再生能力強、產(chǎn)量高和生產(chǎn)性能良好等特點，是鹽化和堿化草甸草原的建群種，也是進行作物耐鹽性改良的優(yōu)質(zhì)野生近緣種之一，其耐鹽機制的闡明對于提高作物耐鹽性有重要價值[6]。

目前利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)已經(jīng)對羊草[7]、半野生棉(Gossypium hirsutum)[8]、野生大豆(Glycine soja)[9]等物種進行過混合鹽堿脅迫后基因表達狀況的研究。對于野大麥耐鹽堿的研究目前大多為生理特性方面，對其根本的耐鹽堿生理機制和主要的耐鹽堿控制基因尚不清楚。本研究用NaCl、NaHCO3模擬鹽堿脅迫，對脅迫后野大麥的生理響應(yīng)進行比較分析，確定其抗鹽堿逆境的臨界濃度，在此基礎(chǔ)上通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對野大麥耐鹽堿相關(guān)基因進行發(fā)掘，不僅在理論上能夠豐富野大麥抗逆性生理內(nèi)容，而且在實踐中能為野大麥及其近緣作物分子育種提供理論支持，對東北草地鹽堿化的修復(fù)及發(fā)展畜牧業(yè)經(jīng)濟具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 種子材料

2017年9月，在扎龍濕地附近草地(47°11′41″ N,124°14′19″ E)采集野大麥種子，自然風干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設(shè)計

使用育苗缽裝入蛭石∶土(V∶V)=1∶3的基質(zhì)培養(yǎng)野大麥至45日齡(株高20 cm左右)，共培養(yǎng)40盆，挑選長勢基本相同的野大麥進行試驗，剝?nèi)ビ缋徍髮⒏炕|(zhì)沖洗干凈，置于錐形瓶中使用 200 mL 1/2霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng) 2 d，之后處理組用 200 mL 1/2霍格蘭營養(yǎng)液配置 100、200、300、400、500 mmol·L-1混合鹽堿溶液 (NaCl與 NaHCO3摩爾比為1∶1)進行脅迫處理，對照組使用200 mL 1/2霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)，處理時間均為2 d。各處理組3次重復(fù)。

1.3 生理指標測定

脅迫2 d后取野大麥葉片進行生理指標的測定，分別為考馬斯亮藍G250法[10]測定可溶性蛋白，酸性茚三酮法[11]測定脯氨酸含量，蒽酮比色法[12]測定可溶性糖含量，NBT光化還原法[13]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，剩余葉片用液氮冷凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析

將保存于-80 ℃冰箱中的野大麥葉片做好標記置于足量干冰中，送往武漢華大基因公司，委托其對樣品進行測序分析，采用Illumina (HiSeq X-Ten)平臺。測序得到的原始數(shù)據(jù)將接頭污染、低質(zhì)量等reads去除從而獲得clean reads，使用Trinity進行組裝獲得轉(zhuǎn)錄本，再將轉(zhuǎn)錄本用Tgicl進行聚類去冗余得到 Unigene，對 Unigene 使用 Blast 2 GO 進行GO功能注釋，使用Blastx進行KEGG注釋。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對生理指標數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進行比較分析(P＜0.05)，數(shù)據(jù)均為平均數(shù) ± 標準差，使用 Graphpad 6.0進行圖表繪制。測序獲得原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI，SRA編號為SRP159891。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理指標測定

隨著混合鹽堿濃度升高，野大麥葉片內(nèi)可溶性蛋白含量呈先升高后降低的趨勢(圖1)，在300 mmol·L-1處理時達到最大值，為14.95 mg·g-1，顯著高于其他濃度處理(P＜ 0.05)；脯氨酸、可溶性糖含量隨脅迫液濃度的增加呈連續(xù)升高趨勢，并都在500 mmol·L-1處理時達到最大，分別為 1 975.15 μg·g-1和 0.60 mmol·g-1，顯著高于其他濃度處理；SOD 活性呈先上升后下降趨勢，在300 mmol·L-1處理時達到最大值，為14.61 U·g-1，顯著高于其他濃度處理；表明野大麥會通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及提升抗氧化酶活性來抵御逆境環(huán)境。根據(jù)生理指標變化趨勢以及參考相關(guān)研究文獻最終選擇300 mmol·L-1處理的野大麥葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，以發(fā)掘相關(guān)耐鹽堿基因。

圖1 混合鹽堿脅迫對野大麥生理指標的影響Figure 1 Effects of mixed saline-alkali stress on physiological indices of wild barley

2.2 測序數(shù)據(jù)過濾及組裝

測序數(shù)據(jù)包含一些接頭污染(6.09%)及低質(zhì)量(7.51%)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析之前需要將其去除，以保證數(shù)據(jù)分析的可靠性。過濾后reads質(zhì)量指標如表1所列，對照組與處理組過濾后reads分別為44.93和45.14 Mb，Q20分別為98.71%和98.72%，過濾后reads比例分別為85.99%和86.38%，過濾后數(shù)據(jù)進行組裝及聚類去冗余以獲得Unigene。對照組與處理組組裝后分別獲得 61 038、61 116個 Unigene(表2)，長度均在200～400 bp范圍內(nèi)數(shù)量最多，分別占38.68%和38.79%，平均長度分別為898和893 bp，N50值分別為1 468、1 453，GC含量分別為51.69%和51.90%，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高能夠進一步進行生物信息學分析。

表1 過濾后reads質(zhì)量統(tǒng)計Table 1 Filtered reads quality statistics

表2 Unigene質(zhì)量指標Table 2 Unigene's quality index

2.3 基因表達情況

在對照組中有8 273個基因特異表達，處理組中有8 646個基因特異表達，51 888個基因共同表達。根據(jù)表達量進行分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，對照組與處理組分別有9 338、10 563個基因為中高水平表達基因，32 594、32 284個基因為較低水平表達基因，18 229、17 687個基因為極低表達水平基因。根據(jù)基因表達水平結(jié)果檢測差異表達基因發(fā)現(xiàn)，處理組相對于對照組有4 163個基因上調(diào)，1 936個基因下調(diào)。

圖2 基因表達量分布Figure 2 Distribution of gene expression

2.4 差異表達基因GO功能分類

對差異表達基因進行GO功能分類(圖3)，可分為生物過程 (4 011個)、細胞組分(5 206個)和分子功能(2 949個)3個主類，每一類又可分別進一步劃分為23、16和13個功能組。生物過程中，有1 050個基因注釋到代謝過程功能組，972個基因注釋到細胞過程功能組；細胞組分中，有1 097個基因注釋到細胞功能組，1 091個基因注釋到細胞部分功能組，894個基因注釋到膜功能組，753個基因注釋到膜部分功能組；分子功能中，有1 307個基因注釋到催化活性功能組，1 233個基因注釋到結(jié)合功能組。

對差異表達上下調(diào)基因進行GO功能分類發(fā)現(xiàn)，混合鹽堿脅迫對各功能組產(chǎn)生不同影響(圖4)。在生物過程主類中，代謝過程、細胞過程等20個功能組上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)，節(jié)律過程、碳利用、氮利用3個功能組下調(diào)基因數(shù)量大于上調(diào)；在細胞組分主類中，細胞、細胞部分、膜等15功能組中上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)，大分子復(fù)合物功能組中下調(diào)基因數(shù)量大于上調(diào)；在分子功能主類中，催化活性、結(jié)合等9個功能組上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)，抗氧化劑活性功能組中下調(diào)基因數(shù)量大于上調(diào)，分子載體活性、毒素活性、翻譯調(diào)節(jié)器活動3個功能組上調(diào)基因數(shù)量與下調(diào)基因數(shù)量持平。說明鹽堿混合脅迫對野大麥生長發(fā)育過程中對代謝過程、細胞過程、細胞、膜、催化活性等生理生化過程相關(guān)基因產(chǎn)生促進作用，對節(jié)律過程、碳利用、氮利用等生理生化過程相關(guān)基因產(chǎn)生抑制作用。

圖3 差異表達基因GO功能分類Figure 3 Differential expression of gene GO function classification

圖4 差異基因上下調(diào)GO功能分類Figure 4 Differential gene up-regulates and down-regulates GO function classification

2.5 差異表達基因KEGG分類

對差異基因進行KEGG分類，4 405個差異基因被分為5個KEGG代謝通路分支(圖5)，分別為細胞過程(紅色，206個)、環(huán)境信息處理(藍色，278個)、遺傳信息處理(綠色，909個)、代謝(紫色，2 635個)和有機系統(tǒng)(橙色，377個)，其中又可以分為23個小類?；旌消}堿脅迫后主要對野大麥體內(nèi)運輸和代謝(206個)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(251個)、翻譯(466個)、碳水化合物代謝(361個)、其他次生代謝產(chǎn)物(284個)、脂質(zhì)代謝(206個)、氨基酸代謝(201個)和環(huán)境適應(yīng)(376個)等相關(guān)基因產(chǎn)生明顯影響，尤其對代謝途徑相關(guān)基因影響較大。

從通路富集角度進行分析可以深入了解差異基因生物學功能，本研究中4 405個差異基因被注釋到132個通路中，直觀地顯示出混合鹽堿脅迫后野大麥體內(nèi)發(fā)生改變的相關(guān)代謝途徑(表3)。分析發(fā)現(xiàn)，淀粉和蔗糖代謝途徑中，蔗糖合成酶(SuS)基因上調(diào)；精氨酸和脯氨酸代謝途徑中，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)基因、谷氨酸激酶(ProB)基因、谷氨酸-5-半醛脫氫酶(ProA)基因上調(diào)表達；過氧化物酶體途徑中超氧化物歧化酶(SOD)基因上調(diào)表達。

3 討論與結(jié)論

植物在受到鹽脅迫時會通過調(diào)節(jié)體內(nèi)生理生化過程來適應(yīng)環(huán)境[14]，而滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是植物遭受滲透脅迫時具有維持細胞滲透壓平穩(wěn)、保護細胞相關(guān)結(jié)構(gòu)等功能的物質(zhì)[15]?？扇苄缘鞍自谥参矬w內(nèi)主要包括一些代謝過程的酶類和滲透調(diào)節(jié)蛋白等物質(zhì)，其含量多少能夠反映出植物體代謝水平的變化，并且維持細胞內(nèi)較低滲透壓等。野大麥經(jīng)混合鹽堿脅迫后體內(nèi)可溶性蛋白呈先上升后下降趨勢，與劉鳳岐等[16]在燕麥(Avena sativa)中的研究結(jié)果相似，對于隨濃度增加可溶性蛋白出現(xiàn)下降趨勢的原因究竟是蛋白質(zhì)合成受阻還是被降解，目前還需深入研究。

可溶性糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物之一，不僅能夠為植物體提供能源，還能作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及信號分子對植物體內(nèi)相關(guān)代謝過程進行調(diào)節(jié)，對植物生長、發(fā)育、抗逆等方面有重要意義[17]。植物遭受滲透脅迫時，會提高包括蔗糖在內(nèi)的可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。目前已有研究在藜麥(Chenopodium quinoa)[18]、小麥(Triticum aestivum)[19]中研究了蔗糖在植物生理生化過程中的作用。本研究中，在轉(zhuǎn)錄層面發(fā)現(xiàn)了蔗糖合成途徑中蔗糖合酶(SuS)編碼基因上調(diào)表達，SuS是高等植物蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其參與蔗糖代謝以及相關(guān)細胞結(jié)構(gòu)的形成[20]，已有研究表明花生(Arachis hypogaea)中SuS編碼基因可能受干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)表達[21]，而本研究發(fā)現(xiàn)SuS編碼基因上調(diào)表達也受混合鹽堿脅迫所誘導(dǎo)，從而增加蔗糖含量進行滲透調(diào)節(jié)以抵御逆境脅迫。

圖5 差異基因KEGG分類Figure 5 Differential gene KEGG classification

脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)劑物質(zhì)，當植物遭受滲透脅迫時，植物體會通過增加脯氨酸含量來維持細胞平穩(wěn)的滲透壓及改善植物內(nèi)環(huán)境[22]。脯氨酸的合成途徑主要分為谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑2種[23]，本研究中鳥氨酸途徑中鳥氨酸轉(zhuǎn)移酶(OAT)及谷氨酸途徑中谷氨酸激酶(ProB)、谷氨酸半醛脫氫酶(ProA)3種酶的編碼基因均上調(diào)表達，使野大麥體內(nèi)產(chǎn)生大量脯氨酸以進行滲透調(diào)節(jié)，以適應(yīng)鹽堿脅迫，由此可見這3種關(guān)鍵酶編碼基因?qū)σ按篼溙嵘鼓嫘杂兄匾饬x。有研究在模式植物煙草中表明OAT編碼基因受干旱、高鹽及低溫等非生物脅迫所誘導(dǎo)，推測其主要功能是促進脯氨酸的生產(chǎn)以此來適應(yīng)逆境脅迫。目前在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中證實ProB、ProA編碼基因過表達能夠明顯增加細胞內(nèi)脯氨酸含量，并且細胞抗逆性提升[24]，但尚未見ProB、ProA編碼基因在植物體中進行功能驗證的相關(guān)報道。

SOD是生物體內(nèi)非常重要的一種抗氧化酶，在清除活性氧、自由基的過程中發(fā)揮首要作用，以避免或減輕細胞所受到的傷害[25]。研究表明，混合鹽堿脅迫會使羊草(Leymus chinensis)[26]、紫花苜蓿(Medicago sativa)[27]等植物體內(nèi)SOD活性升高，將SOD編碼基因轉(zhuǎn)入李樹(Prunus domestica)[28]、煙草 (Nicotiana tabacumvar.Dayanyie)[29]中的研究證明，其能明顯增強植株的耐鹽性。本研究中SOD活性在一定混合鹽堿濃度內(nèi)呈上升趨勢，并且在轉(zhuǎn)錄層面發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體途徑中SOD編碼基因上調(diào)表達，說明野大麥在遭受混合鹽堿脅迫時會通過上調(diào)表達SOD編碼基因、提升SOD活性的方式來適應(yīng)逆境。

東北草地不僅生長著許多典型的鹽生植物，如堿蓬(Suaeda glauca)、朝鮮堿茅(Puccinellia chinampoensis)等，同時還有一些能夠忍受鹽堿環(huán)境的非真鹽生植物，即耐鹽植物(兼性耐鹽植物)，如羊草、野大麥等。耐鹽植物在生理結(jié)構(gòu)上并沒有耐鹽堿的特殊器官或結(jié)構(gòu)，之所以能夠在一定限度鹽堿生境中良好生長，主要原因是通過改變相關(guān)代謝進程進行自我適應(yīng)調(diào)節(jié)，迅速積累相關(guān)代謝產(chǎn)物進行滲透調(diào)節(jié)、維持pH穩(wěn)定等過程[30]。本研究結(jié)果表明，野大麥在遭受混合鹽堿脅迫時，會通過調(diào)節(jié)可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及增加SOD活性的方式來適應(yīng)逆境，通過轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)掘到相關(guān)耐鹽堿基因，為進一步在分子水平深入研究野大麥耐鹽堿性奠定基礎(chǔ)，可為東北鹽堿化草地的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。利用植物耐鹽堿性對鹽堿化草地進行改良，不僅能夠修復(fù)破損的生態(tài)環(huán)境，而且還能實現(xiàn)草業(yè)與畜牧業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的有機結(jié)合，對維護生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定及發(fā)展農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟具有重要意義。

表3 差異基因富集的20條KEGG通路Table 3 20 KEGG pathway with DEGs enrichment