長(zhǎng)穗偃麥草成熟種胚高頻再生體系

周妍彤，郭 強(qiáng)，毛培春，田小霞，崔國(guó)文，孟 林

（1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

長(zhǎng)穗偃麥草(Elytrigia elongata)是小麥族禾本科(Gramineae)偃麥草屬多年生根莖疏叢型草本植物，是小麥(Triticum aestivum)的近緣種，原生于歐洲東南部和小亞細(xì)亞，生境為海濱和鹽堿草甸周圍，具有較強(qiáng)的耐鹽堿性，是改良鹽堿地的理想植物，是小麥不可缺少的野生基因庫(kù)[1]。小麥?zhǔn)菄?guó)內(nèi)重要的主食和谷類作物，由于會(huì)受到生物脅迫和非生物脅迫的影響，其產(chǎn)量和品質(zhì)均不穩(wěn)定[2]。前人利用傳統(tǒng)育種方法在提高小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)上做了大量工作，然而，這些方法的基因庫(kù)有限且育種周期較長(zhǎng)[3]。故而，利用與小麥親緣關(guān)系較近的野生植物基因庫(kù)，如長(zhǎng)穗偃麥草與小麥雜交，成功地將長(zhǎng)穗偃麥草的抗多種病害、耐旱、耐干熱風(fēng)、長(zhǎng)穗或多花等一般小麥品種所缺少的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到普通小麥中，先后選育出小偃4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)，及小偃麥八倍體等雜種新類型，大幅提高了小麥單產(chǎn)[4]。目前，已從長(zhǎng)穗偃麥草中克隆和鑒定出了與抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子EeAP2.2[5]、與耐鹽相關(guān)功能基因EeHKT1;4[6]和品質(zhì)相關(guān)Y型高分子量谷蛋白基因Ee1.5和Ee1.8[7]，但要進(jìn)一步深入分析這些優(yōu)異基因在其抗逆性與品質(zhì)形成中的作用機(jī)理，以及通過(guò)基因編輯技術(shù)，將這些優(yōu)異基因在短時(shí)間內(nèi)編輯用于改良小麥性狀，尚亟待建立一套長(zhǎng)穗偃麥草組織培養(yǎng)植株高頻再生體系。鮑芫和米福貴[8]以種子為外植體，建立了一套長(zhǎng)穗偃麥草和中間偃麥草(E. intermedia)雜交種的組織培養(yǎng)再生體系，誘導(dǎo)率為73%，但分化率僅為37.8%。本研究在借鑒上述長(zhǎng)穗偃麥草與中間偃麥草雜交種組培體系的基礎(chǔ)上，以長(zhǎng)穗偃麥草種子成熟胚為外植體，建立一套完整的高頻組培植株再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為長(zhǎng)穗偃麥草成熟種子，采自國(guó)家精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)研究示范園北京市農(nóng)林科學(xué)院小湯山草資源試驗(yàn)研究基地。

1.2 培養(yǎng)基

在 MC(MS + 30 g·L-1麥芽糖 + 1 g·L-1CH + 5 mL·L-1200× VB + 0.5 g·L-1L-Pro + 3 g·L-1植物凝膠)基礎(chǔ)上，分別添加不同濃度植物激素2,4-D與6-BA構(gòu)成誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基(表1)；生根培養(yǎng)基為MR(1/2 MS + 15 g·L-1麥芽糖 + 3 g·L-1植物凝膠) +0.5 mg·L-1NAA，以上各培養(yǎng)基 pH5.8，115 ℃ 滅菌 20 min。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基組成Table 1 Different combinations of 2,4-D and 6-BA for callus induction and differentiation

1.3 外植體制備及消毒

選取飽滿成熟的種子，在超凈工作臺(tái)上，用消毒滅菌的解剖刀和鑷子小心剝?nèi)シf果外部稃片，保留完整種子，先用70%乙醇消毒2 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，5% NaClO表面消毒30 min，再用無(wú)菌水沖洗3～5次，在無(wú)菌水中浸泡可過(guò)夜；次日用 5% NaClO 消毒 20～30 min，無(wú)菌水沖洗 7～8次，置于無(wú)菌濾紙上自然干燥后，用解剖針挑取種胚在盾片處剪開(kāi)1～2 mm傷口，接種于MS愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中。

1.4 培養(yǎng)條件與方法

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為24 h·d-1黑暗、室溫26 ℃，每種培養(yǎng)基接種成熟胚8枚，9次重復(fù)，第4周觀察統(tǒng)計(jì)其愈傷組織。分化和生根培養(yǎng)條件均為 24 h·d-1光照、室溫 26 ℃、光照強(qiáng)度 2 000 lx，其中分化培養(yǎng)：每種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接5個(gè)愈傷組織，9次重復(fù)，第4周統(tǒng)計(jì)分化情況；生根培養(yǎng)：將分化出芽點(diǎn)并帶有根毛的愈傷組織移入生根培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接5個(gè)愈傷組織，9次重復(fù)，待苗長(zhǎng)10 cm左右時(shí)，開(kāi)蓋煉苗1周，待移栽后統(tǒng)計(jì)成活狀況。誘導(dǎo)與分化均為每2周繼代1次。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

愈傷組織誘導(dǎo)率 = 誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù) × 100%。

分化芽形成率 = 分化芽形成數(shù)/接種的胚性愈傷數(shù) × 100%。

生根率 = 生根數(shù)/接種愈傷數(shù) × 100%。

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析件SPSS 22.0進(jìn)行方差和顯著性分析，利用 Microsoft Excel 2003制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)

將消毒后的成熟胚在盾片處剪開(kāi)1～2 mm傷口接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(圖1A)，7 d后盾片傷口處有玻璃化組織，2周后可在盾片傷口處觀察到海綿狀的愈傷組織，4周后盾片傷口處覆蓋有1 cm左右的白色愈傷組織。經(jīng)一次繼代后，部分白色愈傷組織轉(zhuǎn)化為黃色顆粒狀(圖1B)。僅添加2,4-D時(shí)，隨著2,4-D濃度的增加，成熟胚的誘導(dǎo)率逐漸升高，當(dāng)2,4-D濃度為3 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)73.61%(表2)；與不添加6-BA相比較，培養(yǎng)基內(nèi)添加0.025 mg·L-16-BA愈傷組織生長(zhǎng)速度更快。在添加0.025 mg·L-16-BA基礎(chǔ)上再添加不同濃度比例的2,4-D，隨著2,4-D濃度的增加，誘導(dǎo)率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)2,4-D濃度為3 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率高達(dá)77.78%。結(jié)果表明，誘導(dǎo)長(zhǎng)穗偃麥草成熟種胚愈傷組織的最適激素配比濃度為3 mg·L-12,4-D + 0.025 mg·L-16-BA。

圖1 長(zhǎng)穗偃麥草組織培養(yǎng)植株再生體系Figure 1 Plant regeneration system via tissue culture in Elytrigia elongata

表2 不同濃度激素配比對(duì)長(zhǎng)穗偃麥草成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of various hormone ratios on seed induction in Elytrigia elongata

2.2 愈傷組織分化

將成熟胚的愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，4周后開(kāi)始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。僅添加6-BA時(shí)，隨6-BA濃度的增加，愈傷組織分化率逐漸提高，當(dāng)6-BA的濃度增加到3 mg·L-1時(shí)，分化率最高達(dá) 31.11%(表3)。在添加 0.1 mg·L-12,4-D 基礎(chǔ)上再添加不同濃度比例的6-BA，隨6-BA濃度的增加，分化率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)6-BA濃度為3 mg·L-1時(shí)，分化率高達(dá)66.67%。且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，大部分成熟胚的愈傷組織開(kāi)始分化出許多毛狀根(圖1D)。結(jié)果表明，綠苗分化最適激素濃度配比為 0.1 mg·L-12,4-D + 3 mg·L-16-BA，分化率為66.67%。

表3 不同濃度激素配比對(duì)長(zhǎng)穗偃麥草愈傷組織成熟胚分化的影響Table 3 Effect of various hormone ratios on seed differentiation from callus in Elytrigia elongata

2.3 生根和移栽

將分化出芽點(diǎn)并帶有根毛的愈傷組織移入MR +0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上，生根率達(dá)100%，且根系生長(zhǎng)旺盛。待組培苗生長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)(圖1E)。打開(kāi)培養(yǎng)瓶封口，煉苗一周后，將完整植株移栽至營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為3∶1的基質(zhì)中，隔天澆水，生長(zhǎng)良好，全部成活(圖1F)。

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞具有全能性[9-10]，外植體可以來(lái)自植物的各部位。但外植體選擇極易受到季節(jié)限制或取材限制，且外植體不同，形成愈傷組織的能力不同。近年來(lái)，植物的再生體系中已廣泛應(yīng)用種子為外植體[11-13]。鮑芫和米福貴[8]為避免植物生長(zhǎng)周期限制，利用長(zhǎng)穗偃麥草和中間偃麥草雜交種的種子作為外植體，其誘導(dǎo)率為73%，而分化率僅37.8%。張微等[14]以玉米(Zea mays)成熟胚、幼胚、莖尖和幼嫩葉段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)玉米幼胚的誘愈率和分化率最高為98.3%和57.3%，其次為莖尖、成熟胚，幼嫩葉段相對(duì)較低。趙彥等[15]以蒙古冰草(Agropyron mongolicum)幼苗的不同部位為外植體，其中莖尖誘愈率最高，為79.3%，而莖段、葉片誘愈率明顯低于莖尖，分別為46.0%和7%。

植物內(nèi)源激素影響植物內(nèi)在變化，外植體離體情況下植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)的過(guò)程中調(diào)節(jié)植物組織培養(yǎng)過(guò)程[16]。禾本科牧草進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，一般單獨(dú)添加2,4-D，促進(jìn)外植體脫分化、促進(jìn)愈傷組織增殖。吳桂勝等[17]以匍匐剪股穎(Agrostis stolonifera)的成熟種子為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，培養(yǎng)基中添加 6 mg·L-12,4-D 誘導(dǎo)率為68.1%。何勇等[18]以高羊茅(Festuca arundinacea)的成熟胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，培養(yǎng)基中添加18 mg·L-12,4-D 誘導(dǎo)率為 95.6%。本研究中 2,4-D 濃度為3 mg·L-1時(shí)，長(zhǎng)穗偃麥草成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)73.61%。王萬(wàn)軍等[19]研究表明，添加6-BA可以改善小麥愈傷組織的狀態(tài)。本研究也證實(shí)添加 0.025 mg·L-16-BA 時(shí)，愈傷組織狀態(tài)較不添加時(shí)要好，且對(duì)誘導(dǎo)效果也有明顯的作用，最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MC + 3 mg·L-12,4-D + 0.025 mg·L-16-BA。

植物體細(xì)胞胚性發(fā)生時(shí)起到重要作用的激素是2,4-D[20]，誘導(dǎo)愈傷組織分化的激素是細(xì)胞分裂素[21]，在禾本科植物中6-BA誘導(dǎo)分化的效果要優(yōu)于其他分裂素。在誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織后，降低2,4-D濃度，提高6-BA濃度可促進(jìn)愈傷組織分化芽點(diǎn)，促進(jìn)不定芽的形成。本研究中，最佳分化培養(yǎng)基為 MC + 0.1 mg·L-12,4-D + 3 mg·L-16-BA，成熟胚愈傷組織分化，伴隨形態(tài)學(xué)上端芽點(diǎn)生成的同時(shí)，形態(tài)學(xué)下端形成毛狀根。因此，為提高分化生根的數(shù)量和質(zhì)量選用 MR + 0.5 mg·L-1NAA生根培養(yǎng)基。

以長(zhǎng)穗偃麥草成熟胚為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，成功建立了一套長(zhǎng)穗偃麥草種子成熟胚的組織培養(yǎng)再生體系，其中誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng) 基 為 MC + 3 mg·L-12,4-D + 0.025 mg·L-16-BA，分化培養(yǎng)基為 MC + 0.1 mg·L-12,4-D + 3 mg·L-16-BA，生根培養(yǎng)基為 MR + 0.5 mg·L-1NAA，生根率達(dá)100%，且移栽至營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為3∶1的基質(zhì)中，隔天澆水，植株全部成活，生長(zhǎng)良好。該體系的建立可為進(jìn)一步研究長(zhǎng)穗偃麥草的抗逆分子機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。