脫毒馬鈴薯種質資源保存新方法

包永佶 劉連成 田孝威 薛玉平 丁建國 葉 巍 魯文娟

（威海市農業(yè)科學院，山東威海 264200）

相比馬鈴薯試管苗一般保存法，試管薯保存法操作更簡單，1 a（年）轉苗1次即可，省工省力、成本低、效果好，還能保持品種原有的特性，適用于大規(guī)模馬鈴薯種質資源的試管苗保存庫。

馬鈴薯種質資源的保存主要有3種方式：塊莖保存、田間保存和試管苗保存（卞春松 等，2011）。由于試管苗保存法具有保存成本低、節(jié)約空間等優(yōu)點，目前世界上許多國家都采用此法保存馬鈴薯種質資源（楊小琴 等，2016）。試管苗保存法又可以分為一般（常溫）保存法和緩慢（低溫）保存法（張小川 等，2017），一般保存法是試管苗在20～24 ℃常溫下不斷繼代培養(yǎng)保存資源，緩慢保存法則是通過調節(jié)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)環(huán)境來延緩試管苗生長或停止生長保存資源。一般保存法的缺點是需要定期轉苗繼代培養(yǎng)，通常2～3個月轉苗1次（齊恩芳 等，2015），不僅需要較多的人力、物力、財力，而且多次操作會增加污染幾率；緩慢保存法則對保存條件要求較高，需要一定的低溫設施設備和投入資金，也提高了一般實驗室對馬鈴薯種質資源保存的門檻。

筆者采用保存脫毒馬鈴薯試管薯的方式進行種質資源保存，即經過3～4個月讓馬鈴薯試管苗在試管中自然結成試管薯，此時對試管薯不做任何處理，繼續(xù)于培養(yǎng)室試管中保存，直至試管薯度過休眠期開始萌芽；再從試管中移出欲萌芽的試管薯，在新的培養(yǎng)基中進行新一輪培養(yǎng)，繼續(xù)保存培養(yǎng)試管薯，整個過程可簡化為脫毒試管苗→試管薯→試管苗→試管薯→微型薯。通過2 a（年）多的試驗探索，發(fā)現(xiàn)試管薯保存法和試管苗一般保存法最終的保存效果相同，且試管薯保存法操作更簡單，試管苗一般保存法1 a（年）需轉苗5次，試管薯保存法1 a（年）轉苗1次即可，節(jié)約了保存成本，可節(jié)省電量50%，對大規(guī)模馬鈴薯種質資源的試管苗保存庫來說操作性更好；并且以試管薯方式保存的資源一旦需要組培快繁，則其繼代培養(yǎng)更健壯；若進行土壤移栽種植，相比試管苗不僅成活率高、出苗壯，而且結薯產量高、個數(shù)多。據(jù)筆者了解，目前試管薯保存法尚未在馬鈴薯種質資源保存中規(guī)?；瘧茫且环N保存馬鈴薯種質資源的新方法。

1 試驗具體操作步驟

1.1 試管苗培育 馬鈴薯脫毒試管苗由山東省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供，4個品種分別為魯引1號、H2013-1、H2013-3、H2013-8。培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+白糖30 g·L-1+瓊脂8 g·L-1；將培養(yǎng)基（45 mL）盛入試管（30 mm×200 mm）保存脫毒試管苗。

1.2 試管苗一般保存法和試管薯保存法 試管苗一般保存法：剪取試管苗頂端（含2片葉），轉移到試管中，每個品種保存2個試管，每個試管培養(yǎng)1株。培養(yǎng)溫度（24±1）℃，光照16 h（小時），光照強度為2 800～3 100 lx（3個LED燈管），繼代培養(yǎng)周期70 d（天），1 a（年）轉苗5次。

試管薯保存法：剪取試管苗頂端（含2片葉），轉移到試管中，每個品種保存2個試管，每個試管培養(yǎng)1株。培養(yǎng)溫度（24±1）℃，光照16 h（小時），光照強度2 800～3 100 lx（3個LED燈管），培養(yǎng)80 d（天）。當苗高接近試管口時將LED燈管從3個調為2個，光照強度1 800～2 200 lx。繼續(xù)培養(yǎng)110 d（天）左右，待有試管薯陸續(xù)結出后保留1個LED燈管，光照強度750～900 lx，繼續(xù)在培養(yǎng)室中保存至試管苗葉片發(fā)黃枯萎，直至試管薯結束休眠期開始萌芽。然后將要萌芽的試管薯直接轉入含有MS培養(yǎng)基的新試管中，每個試管保存1粒試管薯，培養(yǎng)溫度（24±1）℃，光照16 h（小時），光照強度2 800～3 100 lx，待新芽長成新植株后，剪取幼苗頂端移入新試管中，重復保存過程。

1.3 病毒檢測 兩種方法保存1 a（年）后，分別用美國agdia公司生產的試紙條對試管苗進行馬鈴薯X病毒、Y病毒、A病毒、S病毒檢測。

1.4 微型薯生產 將試管苗和試管薯分別在長×寬×高為40 cm×30 cm×15 cm規(guī)格的塑料箱內進行土壤種植，正常管理收獲馬鈴薯微型薯。

2 保存效果

2.1 成本比較 從表1可以看出，在轉苗次數(shù)上，試管苗一般保存法平均每年繼代轉苗5次，需要進行5次培養(yǎng)基配制、轉苗操作、清洗等配套工序，而試管薯保存法完整配套工序只需1次，節(jié)約了物質成本和人力成本。其次，試管薯保存法降低了用電成本，試管苗一般保存法全年在恒溫和恒定光照條件下繼代培養(yǎng)；試管薯保存法在前80 d（天）與試管苗一般保存法培養(yǎng)條件相同，即打開3個LED燈管，第2階段保留2個燈管培養(yǎng)110 d（天），到第3階段保留1個燈管培養(yǎng)170 d（天），光照強度由3 100 lx減弱至750 lx，可節(jié)省電量50%左右。

2.2 試管薯結薯情況 早熟品種H2013-3最早結薯，65～70 d（天）開始出現(xiàn)小薯；魯引1號次之，基本在80 d（天）結薯，以后慢慢由小到大長成試管薯，葉片變黃枯萎早，休眠時間短，萌芽也早；晚熟品種H2013-8、H2013-1試管薯結薯時間晚，95～110 d（天）陸續(xù)出現(xiàn)小薯，休眠期長，萌芽亦晚，由試管薯第2輪培育成為試管苗的周期更長。不同品種的試管薯結薯數(shù)量基本相同，每株結薯2～4粒，2粒居多（圖1）。

在多次重復試驗中發(fā)現(xiàn)，試管苗結薯與培養(yǎng)光照強度和溫度有密切的關系。培養(yǎng)光照強度越大、溫度越高，試管苗的枝葉生長越快、越健壯；試管苗培養(yǎng)達到成熟階段后其結薯則是溫度越低、培養(yǎng)時間越短、光照強度越弱越有利于結薯。由于筆者是以保存為目的，保存的時間越久越好，操作越簡單越好，所以未對培養(yǎng)室的溫度做過多調節(jié)。

表1 試管苗一般保存法與試管薯保存法對比結果

圖1 試管薯結薯情況

2.3 試管薯發(fā)芽繼代培育情況 和試管苗一般保存法相比，由試管薯發(fā)芽的芽苗莖更粗壯，葉片厚實且更大，顏色更深綠（圖2）；兩種保存方法獲得的試管苗均未檢測出馬鈴薯X病毒、Y病毒、A病毒、S病毒。

圖2 試管薯發(fā)芽繼代培育情況

圖3 試管苗收獲的微型薯

圖4 試管薯收獲的微型薯

2.4 微型薯生產情況 在塑料箱內進行微型薯生產，試管苗移栽和試管薯種植后均獲得微型薯。試管苗移栽初期對空氣濕度、溫度等外界環(huán)境和管理者的要求較高；試管薯直接種植于土壤中，管理上較為寬松，成活率高于試管苗。后期正常管理，成熟后收獲。結果表明，試管苗生產的微型薯偏小，但形狀、大小整齊（圖3）；試管薯生產的微型薯質量較大，但大小不一，整齊度偏差（圖4）。兩者的葉片均沒有卷葉、黃葉等癥狀，對其進行病毒檢測，也均未檢測出馬鈴薯X病毒、Y病毒、A病毒和S病毒，收獲后各品種特性無異常。

3 小結

在馬鈴薯種薯生產上，國家標準認定試管薯等同于試管苗均為原原種級別。馬鈴薯試管薯保存法完全在常規(guī)溫度下進行，培養(yǎng)基也是采用普通MS培養(yǎng)基，從根本上避免了低溫培養(yǎng)或者增添植物抑制生長成分等外界干擾給保存資源帶來的不確定因素，確保了資源的純凈性。因為對培養(yǎng)室保存的培養(yǎng)條件沒有特殊要求，所以一般的組培實驗室都可以采用試管薯保存法保存馬鈴薯種質資源。在操作過程中需要注意的問題是，由于試管苗在試管中保存的時間很長，對試管塞的要求很高，筆者在自制的棉花塞外包裹雙層牛皮紙確保試管口的密封性，保存過程中定時查看扎口的膠皮筋，對老化斷裂的膠皮筋及時進行更換，并對培養(yǎng)室定期滅菌。為了更好地節(jié)省馬鈴薯種質資源保存成本，采用試管薯保存法時，可在保存試管薯的第3階段讓試管苗的莖葉充分枯萎，使試管薯在逐漸失去水分的培養(yǎng)基中保存的時間更長久。筆者又對本次試驗做了后續(xù)補充，將第3階段所得的未萌芽的試管薯仍然放置于MS培養(yǎng)基中，保存時間又可延長2～6個月，其發(fā)芽時間因品種的早晚成熟度而異，晚熟品種的保存時間更長，基本可達15～18個月，此結果與齊恩芳等（2015）的研究結果一致。