基于賴氨酸修飾膠體金的花生黃曲霉毒素B1檢測

黃星奕 葉偉濤 王成全 呂日琴 孫兆燕

(江蘇大學食品與生物工程學院， 鎮(zhèn)江 212013)

0 引言

花生是我國產(chǎn)量豐富、食用廣泛的一種堅果[1]。在夏季高溫、高濕情況下，花生易發(fā)生霉變，在霉變過程中會產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、黑曲霉毒素等霉菌毒素[2-4]。研究表明，在所有已知的霉菌毒素中，黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的毒性、致畸性、致癌性均居于首位，其半數(shù)致死量(LD50)為0.294 mg/kg[5]。我國對農(nóng)產(chǎn)品中AFB1含量具有嚴格的限制，規(guī)定花生及其制品中AFB1的含量(質(zhì)量比)不得超過20 μg/kg[6]。農(nóng)產(chǎn)品中AFB1的檢測，對于減少霉菌毒素的危害具有重要的意義。

傳統(tǒng)的霉菌毒素檢測方法主要有生物學檢測法、薄層分析法、高效液相色譜法等[7]，由于這些方法操作復雜、預處理繁瑣、處理時間長，研究者正不斷開發(fā)新的檢測方法[8]。納米材料由于其量子尺寸效應，表現(xiàn)出與其他傳統(tǒng)材料不同的特性，如光學性質(zhì)、磁學性質(zhì)、光催化作用等[9-11]，國內(nèi)外學者嘗試使用納米材料檢測霉菌毒素。文獻[12]利用AFB1抗體包被納米金，制備了可用于小麥粉中AFB1快速檢測的新型安培免疫傳感器，檢測限為0.3 μg/L。文獻[13]通過合成的納米粒子與黃曲霉毒素人工抗原抗體的競爭免疫結合，實現(xiàn)了新型的AFB1檢測方法，檢測限為0.03 ng/mL。文獻[14]利用納米粒子建立了一種OTA(赭曲霉毒素A)檢測體系，通過溶液中游離的cDNA與加入的Ag+在NaBH4的存在下形成強熒光的納米粒子，從而實現(xiàn)OTA的檢測，檢測限為2 pg/mL。文獻[15]以磁性材料為載體，不同納米材料為信號探針，構建磁控適配體比色、熒光、電化學傳感體系，成功檢測出花生中赭曲霉毒素A和伏馬毒素B1。

傳統(tǒng)的膠體金標記技術的實驗步驟較為繁瑣，需要構建人工抗原抗體，從而實現(xiàn)標記[16]。本文以膠體金為介質(zhì)，制備賴氨酸修飾的金膠體系，以實現(xiàn)對霉變花生中AFB1的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-2450型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；JEOL 2100型透射電鏡(日本JEOL公司)；LA-20型高效液相色譜儀(日本島津公司)，配有熒光檢測器；11830-RT型氮吹儀(美國Organomation公司)；DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器(河南鞏義市予華儀器廠)；TG16-WS型臺式高速離心機(長沙湘儀有限公司)；XH-D型漩渦振蕩器(無錫杰瑞安儀器設備有限公司)。

1.2 試劑

AFB1、OTA、FB1(伏馬毒素B1)、氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸三鈉，購于Sigma-Aldrich公司；L-賴氨酸、三氟乙酸、正己烷，購于薩恩化學技術有限公司；HgCl2，購于山東西亞化學股份有限公司；乙腈，購于美國TEDIA公司；試驗用水為二次去離子水。

1.3 賴氨酸修飾的膠體金制備

本實驗采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[17]，首先，稱取8.9 mg的氯金酸固體粉末溶于100 mL的超純水中，加熱到沸騰，迅速加入12 mL的1%檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)加熱。觀察溶液的顏色變化，當溶液的顏色完全變?yōu)橥该?、澄清的酒紅色時，停止加熱。待溶液冷卻至室溫(20℃)，4℃避光保存[18]。然后將5 mL的15 mol/L賴氨酸水溶液加入45 mL所制備的AuNPs(膠體金)中，150 r/min攪拌10 min，制備得到賴氨酸修飾的膠體金(Lys-AuNPs)溶液。利用紫外可見分光光度計和透射電鏡對其進行表征。

1.4 AFB1測定原理與方法

Hg2+能夠與AFB1形成穩(wěn)定的螯合物。Hg是過渡金屬元素，并且容易形成配位數(shù)為6的絡合物。它的幾何構型通常相當于由6個配位原子形成的八面體，使得配合物AFB1-Hg2+的共軛平面增強，剛性結構增加[19]。

本實驗通過檸檬酸三鈉還原HAuCl4制得膠體金，生成的溶液是一種膠體溶液，Lys-AuNPs粒子的表面覆蓋著賴氨酸，顆粒之間通過靜電排斥作用使得賴氨酸修飾的膠體金溶液保持著穩(wěn)定性[20]。如圖1所示，當溶液中加入HgCl2時，Hg2+會與賴氨酸上的氨基發(fā)生作用，破壞膠體溶液的穩(wěn)定性，使溶液產(chǎn)生凝聚，顏色變成灰黑色。當溶液中混入AFB1，則Hg2+會與AFB1發(fā)生螯合反應，生成穩(wěn)定的配合物，從而使破壞膠體溶液穩(wěn)定性的Hg2+減少，隨著AFB1濃度的升高，溶液中游離的Hg2+不斷減少，顏色逐漸變?yōu)榧t色。通過紫外可見分光光度計對溶液進行吸光度測定，然后建立AFB1濃度與吸光度之間的相關關系。

圖1 賴氨酸修飾的膠體金溶液檢測AFB1原理示意圖Fig.1 Schematic of AFB1 detection by lysine-functionalized gold nanoparticles

在5 mL的離心管中加入15 μmol/L的HgCl2溶液100 μL和不同濃度的AFB1900 μL，漩渦振蕩3 min，混勻。在混合液中加入1 mL的Lys-AuNPs溶液，漩渦振蕩5 min。用紫外可見分光光度計測其吸收光譜，根據(jù)在725 nm和525 nm處吸光度比值建立AFB1濃度的校準曲線。

1.5 花生樣本的制備

本批次實驗花生仁樣本均產(chǎn)于江蘇省南通市，品種為冀花4號，并參考GB 5009.22—2016的方法進行預處理。首先，將花生樣品研磨成粉末，稱取0.5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中。再加入20 mL質(zhì)量分數(shù)25%的乙腈，漩渦混勻。然后用均質(zhì)機均質(zhì)3 min，在6 000 r/min下離心10 min，取其上清液備用。

1.6 AFB1的高效液相色譜法測定

色譜條件：流動相為25%乙腈；色譜柱為C18柱；流速1.0 mL/min；柱溫40℃；進樣體積50 μL；檢測波長360 nm；發(fā)射波長440 nm。

柱前衍生：用移液管吸取4 mL的待測液于10 mL的離心管中，然后在50℃下用氮氣慢慢地吹至近干，再加入200 μL的正己烷與100 μL的三氟乙酸，漩渦振蕩30 s。在40℃的恒溫箱中衍生15 min，在50℃下用氮氣緩緩地吹至近干。用25%乙腈定容至1 mL，漩渦振蕩30 s溶解殘留物，最后過0.45 μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中備用。

2 結果與討論

2.1 Lys-AuNPs溶液的表征與分析

將制備得到的賴氨酸修飾的膠體金溶液在透射電鏡下進行觀察，Lys-AuNPs的粒徑大約為25 nm，圖2為膠體金溶液在不同狀態(tài)下的電鏡圖，圖2a為賴氨酸修飾的膠體金溶液，顆粒間分散性良好；圖2b中顆粒之間發(fā)生凝聚現(xiàn)象；圖2c中顆粒之間又重新分散開。如圖3所示，從紫外可見光譜圖中可以發(fā)現(xiàn)Lys-AuNPs溶液僅在525 nm處存在一個吸收峰；當溶液中加入Hg2+時，溶液顏色會變成灰黑色，且溶液發(fā)生凝聚現(xiàn)象，會在525 nm和725 nm處形成2個吸收峰；當溶液中加入Hg2+和20 ng/mL的AFB1時，溶液在525 nm處的吸光度增加，在725 nm處的吸光度減小。

圖2 膠體金溶液不同狀態(tài)下的透射電鏡圖Fig.2 TEM images of different states of gold nanoparticles solution

圖3 溶液中加入Hg2+和AFB1后Lys-AuNPs的紫外可見光譜Fig.3 UV-visible spectra of gold nanoparticles solution after adding Hg2+ and AFB1

2.2 梯度實驗

在Lys-AuNPs和Hg2+離子濃度一致的情況下，向體系中加入不同質(zhì)量濃度(0、1、2.5、5、10、20、50、100、300、400、500 ng/mL)的AFB1溶液，混勻、平衡后觀察其在不同質(zhì)量濃度AFB1下Lys-AuNPs溶液的顏色變化和凝聚情況，并用紫外可見分光光度計測量混合后溶液的吸光度，其紫外可見光譜圖如圖4所示。

圖4 溶液在不同AFB1質(zhì)量濃度下的紫外可見光譜Fig.4 UV-visible spectrogram of different concentrations of AFB1

圖5 溶液在不同AFB1質(zhì)量濃度下的顏色Fig.5 Color of solutions with different concentrations of AFB1

當AFB1的質(zhì)量濃度發(fā)生變化時，溶液的顏色也會產(chǎn)生相應的變化，如圖5所示。當溶液中沒有混入AFB1，只有Lys-AuNPs和Hg2+時，溶液呈灰黑色，此時溶液在525 nm處和725 nm處有兩個吸收峰；隨著AFB1質(zhì)量濃度的不斷增加，溶液的顏色由灰黑色逐漸變淡，最后向紅色轉變，Lys-AuNPs溶液在525 nm處的吸光度緩慢下降，而725 nm處的吸光度不斷增加；當溶液中Hg2+全部與AFB1形成配合物時，溶液顏色變?yōu)榧t色，此時，紫外可見光譜圖中只剩下一個吸收峰。觀察溶液在525 nm和725 nm處雙峰吸光度與AFB1濃度之間的關系可知，Lys-AuNPs溶液在725 nm處的吸光度A725與在525 nm處的吸光度A525之間的比值A725/A525隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加而減小，逐漸趨向0。通過分析Lys-AuNPs溶液中AFB1質(zhì)量濃度與A725/A525的相關關系發(fā)現(xiàn)，當溶液中AFB1質(zhì)量濃度在1～50 ng/mL時，A725/A525與AFB1質(zhì)量濃度有較好的線性關系，如圖6所示，線性回歸方程為y=-0.010 5x+1.144 7，決定系數(shù)R2=0.996，檢出限為0.2 ng/mL。

圖6 A725/A525與AFB1質(zhì)量濃度之間的關系Fig.6 Relationship between concentration of AFB1 and A725/A525 value

2.3 回收率和相對標準偏差

選取正?；ㄉ鷮⑵溲心コ煞勰?，在50 mL的離心管中稱取4份花生粉末，每份0.5 g，將等體積不同質(zhì)量濃度的AFB1(0.5、1、10、50 ng/mL)，加入20 mL的50%乙腈，漩渦混合，用均質(zhì)機均質(zhì)3 min，在6 000 r/min下離心10 min。然后利用Lys-AuNPs溶液測AFB1的質(zhì)量濃度，得其加標回收率分別為85.0%、97.2%、110%、95.5%，平均加標回收率為96.9%，相對標準偏差為8.9%。

2.4 Lys-AuNPs溶液的特異性

為了研究本實驗中制備的Lys-AuNPs溶液的特異性，通過選用霉變花生仁中其它霉菌毒素，如OTA和FB1作為干擾霉菌毒素，進行驗證。取900 μL質(zhì)量濃度為5 ng/mL的AFB1、OTA、FB1分別加入3支10 mL的離心管內(nèi)，在離心管中分別加入15 μmol/L的HgCl2溶液100 μL，漩渦振蕩3 min，使其充分混合。然后在每個離心管的混合液中分別加入1 mL的Lys-AuNPs溶液，漩渦振蕩5 min，并用紫外可見分光光度計測其吸收光譜。圖7為分別加入AFB1、FB1、OTA后的紫外可見光譜圖，與空白組相比，加入5 ng/mL AFB1的溶液在525 nm處的吸光度明顯上升，725 nm處的吸光度顯著降低，而加入OTA與FB1的溶液的吸光度幾乎沒有變化。數(shù)據(jù)表明，目標物中混入AFB1時的吸光度變化率遠高于混入OTA與FB1。由以上結果表明，此方法所構建的賴氨酸修飾的膠體金體系有較好的選擇性，霉變花生仁中存在的OTA和FB1并不會影響AFB1質(zhì)量濃度的檢測，基于此建立的花生仁中AFB1含量的檢測方法具有良好的特異性。

圖7 AFB1、FB1、OTA的紫外可見光譜Fig.7 UV-visible spectrogram of AFB1, FB1 and OTA

2.5 AFB1含量的高效液相色譜法測定

用本研究提出的Lys-AuNPs溶液檢測AFB1的方法檢測溶液中AFB1的質(zhì)量濃度，并用高效液相色譜法(HPLC)對AFB1的質(zhì)量濃度進行驗證。選取40個花生樣品對其AFB1質(zhì)量濃度進行測定與比較，由圖8可知，用高效液相色譜法和Lys-AuNPs溶液測定的AFB1質(zhì)量濃度的均方根誤差為0.865 1 ng/mL，相關系數(shù)為0.996 1。結果表明由本實驗所建立的賴氨酸修飾的膠體金體系可用于花生中AFB1的檢測。

圖8 用Lys-AuNPs和HPLC測定AFB1濃度的比較Fig.8 Comparison of results for AFB1 concentration determined by Lys-AuNPs and HPLC methods

3 結束語

提出了一種新的霉變花生中AFB1檢測方法：用賴氨酸修飾的膠體金溶膠體系對霉變花生中AFB1進行檢測。該方法無需使用光敏材料、酶試劑等，具有快速、簡單、特異性好等優(yōu)勢，并且無需制備復雜的特異性抗體來檢測黃曲霉毒素。Lys-AuNPs溶液檢測AFB1的線性范圍為1～50 ng/mL，決定系數(shù)0.996，檢出限為0.2 ng/mL，平均加標回收率為96.9%，相對標準偏差為8.9%。該方法快速、準確、靈敏，可用于霉變花生中AFB1的檢測。