食用菌提取多糖對(duì)酒精性肝損傷改善測試*

董瑞瑞，程傳喜，蔣文娟

（1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 新鄭 451150；2.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450000）

肝臟可以擔(dān)負(fù)解毒和分泌等功能。近些年酒精性的肝病死亡率逐漸上升，已經(jīng)引起了醫(yī)療行業(yè)的高度重視和深度研究［1-2］。酒精性肝損傷主要指的是在短時(shí)間內(nèi)飲入超出負(fù)荷的酒，導(dǎo)致肝臟解毒能力不堪重負(fù)引起的肝器官受損。

當(dāng)前酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，不過其治療方案突破不是很大，還無法高效治療此類病癥［3-4］。目前臨床上比較常用的酒精性肝損傷治療方案一般為營養(yǎng)支持、水飛薊素等。上述方法雖然在一定程度上能夠消除酒精帶來的氧化應(yīng)激，但此類治療方案存在著療效不確定性強(qiáng)和副作用大等不足［5-6］。

針對(duì)上述情況，提出利用食用菌提取多糖對(duì)酒精性肝損傷進(jìn)行改善與治療。

1 食用菌多糖提取

1.1 儀器和試劑

多糖提取儀器：旋轉(zhuǎn)式的蒸發(fā)儀器；電子天平和紅外光譜儀。

多糖提取試劑：蒽酮、純度為95%的乙醇、濃硫酸、葡萄糖和石油醚、乙醚及三氯乙酸。在實(shí)驗(yàn)過程中所用水為蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)用到的食用菌為姬菇Hypsizigus marmoueus（Peck）Bigelw。

標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖溶液調(diào)制過程為：精準(zhǔn)稱取105℃使其干燥一直到恒重，分析純葡萄糖的對(duì)照品110 mg，加入少量水將其溶解，放置到110 mL容量瓶中，以此調(diào)制成1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖試劑。選取25 mL的1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶劑，將水放到溶液中定容到500 mL，溶液濃度是50 g·mL-1。

1.2 多糖提取

稱風(fēng)干粉碎食用菌樣品并精準(zhǔn)到0.000 2 g，經(jīng)過回流去除脂肪，干燥。

選取脫脂樣品干粉形式與蒸餾水以1∶25配比添加二次蒸餾水，將溫度設(shè)置成90℃，時(shí)間設(shè)置為3 h，次數(shù)設(shè)置為3次。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并得到的溶液進(jìn)行濃縮，濃縮至大約25 mL即可。將其5倍體積大概125 mL 95%乙醇進(jìn)行沉淀，并密封放24 h。利用砂芯漏斗對(duì)沉淀品進(jìn)行過濾，然后抽干，用10 mL的水復(fù)溶，添加3%的三氯乙酸，一直到不再生成白色沉淀，將蛋白質(zhì)去除，對(duì)溶液進(jìn)行濃縮，添加125 mL乙醇醇析。將所得樣品靜置過夜，過濾，利用10 mL的乙醇清洗2次，利用10 mL的乙醚清洗1次，得到食用菌多糖樣本。

2 食用菌多糖對(duì)酒精性肝損傷改善測試

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

將上述中得到的食用菌多糖樣本和雄性實(shí)驗(yàn)小白鼠當(dāng)作主要實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)鼠為6周齡，體重大約20 g，上下波動(dòng)2 g。

實(shí)驗(yàn)用的主要試劑為：甲硫氨酸、二甲苯、肝素、四乙氧基丙烷、ALT、AST和TG等。

實(shí)驗(yàn)主要使用到的器材有：分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀和超聲破碎儀。

2.2 方法

2.2.1 構(gòu)建酒精性肝損傷模型

將實(shí)驗(yàn)鼠喂養(yǎng)3 d，并隨機(jī)分成對(duì)照組和模型組以及多糖組，每組實(shí)驗(yàn)鼠為14只。利用蒸餾水和實(shí)驗(yàn)樣品配制，每天對(duì)測試樣品灌胃一次，持續(xù)30 d。在實(shí)驗(yàn)期間給實(shí)驗(yàn)鼠提供顆粒飼料，在飲食與飲水方面均不予控制。當(dāng)實(shí)驗(yàn)到31 d時(shí)，每組實(shí)驗(yàn)鼠禁飲水和吃食12 h之后，模型組用50%的乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行灌胃，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)鼠酒精性肝損傷模型，對(duì)照組用同體積蒸餾水對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行灌胃。將死亡實(shí)驗(yàn)鼠去除，各個(gè)組選出10只鼠在模型構(gòu)建12 h之后取眼球并進(jìn)行采血，將血清分離，并分別測定ALT、AST、TG之后，迅速處死實(shí)驗(yàn)鼠。取實(shí)驗(yàn)鼠肝臟并設(shè)計(jì)為石蠟以及超薄的切片做病理檢查與細(xì)胞超微構(gòu)造觀察，剩余肝臟在-80℃下保存留作備用，以實(shí)現(xiàn)抗氧化損傷情況的測定［7-8］。

2.2.2 制備肝勻漿

選取實(shí)驗(yàn)鼠肝進(jìn)行稱重，并利用生理鹽水將表面的污垢清除干凈，剪碎之后加入已預(yù)冷的50 mmol·L-1磷酸緩沖液中［9-10］。將處理中的樣本放到冰水中超聲破碎并制成10%的肝勻漿，用于MDA等指標(biāo)的測定。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)狀況觀測

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中觀察實(shí)驗(yàn)鼠毛發(fā)光澤程度和精神狀態(tài)以及死亡等狀況并記錄。在實(shí)驗(yàn)之前稱重，實(shí)驗(yàn)后每周稱實(shí)驗(yàn)鼠體重一次并記錄，一直到處死實(shí)驗(yàn)鼠。

2.2.4 測定指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

分別對(duì)ALT、AST、TG、MDA等進(jìn)行測定，并通過SPSS17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。其中，單因素方差利用檢驗(yàn)組之間進(jìn)行兩兩差異性對(duì)比得到。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 食用菌多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠體重產(chǎn)生的影響

對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行處理，持續(xù)4周，在4周中按照常規(guī)飼養(yǎng)方式喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。和對(duì)照組相比，多糖組實(shí)驗(yàn)鼠的生長以及精神狀態(tài)與體重方面未存在異常，也沒有出現(xiàn)中毒與死亡的情況。一直到第30天多糖組實(shí)驗(yàn)鼠平均體重和空白組相比并無明顯差異。

表1 食用菌多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠體重產(chǎn)生的影響Tab.1 Effect of polysaccharide on body weight of rats

3.2 食用菌多糖對(duì)酒精性肝損傷影響

酒精性肝損傷影響結(jié)果見表2。當(dāng)提供50%乙醇溶液之后，實(shí)驗(yàn)鼠先呈現(xiàn)出了興奮狀態(tài)，然后行走不穩(wěn)，四肢難以支撐，0.5 h后醉倒且呼吸比較急促，還存在抽搐的情況，該狀態(tài)大概持續(xù)了1 h。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)鼠的精神狀態(tài)良好，且食欲旺盛，在12 h之后模型組實(shí)驗(yàn)鼠狀態(tài)普遍比較差，且精神萎靡，毛色光澤性不強(qiáng)，活動(dòng)也有所減少。對(duì)照組和多糖組無變化，但模型組的實(shí)驗(yàn)鼠存在死亡跡象，死亡時(shí)間大概集中在1 h～2 h。和酒精模型組比較，多糖組實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)酒精性肝損傷有明顯的抑制效果，存活率高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，食用菌多糖對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)和改善作用。

表2 食用菌多糖對(duì)酒精性肝損傷影響Tab.2 Effect of edible fungi on alcoholic liver injury

4 結(jié)語

上述研究中，利用提取食用菌多糖將小老鼠當(dāng)作實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)酒精性肝損傷改善性能進(jìn)行測試。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，食用菌多糖對(duì)于酒精性肝損傷具備良好地改善作用，可顯著降低肝損傷程度，以保障肝功能具有相對(duì)完整性。通過以上實(shí)驗(yàn)與分析，力爭為開發(fā)護(hù)肝藥物提供一定依據(jù)。