降解玉米秸稈的毛頭鬼傘菌株的初步篩選*

楊文琪，黃 亮，孫 寧，王 玉，班立桐，楊紅澎

（天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院，天津 300384）

中國的秸稈資源十分豐富，約占農(nóng)作物生物學產(chǎn)量的60%，其中稻秸稈產(chǎn)量最大，約占總秸稈產(chǎn)量的29.93%；其次是玉米秸稈，約占總秸稈產(chǎn)量的27.39%［1］。秸稈作為天然木質(zhì)纖維素，約由35%纖維素、15%半纖維素、15%木質(zhì)素3部分組成。其中木質(zhì)素呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成支撐纖維素和半纖維素的骨架，以共價鍵的形式緊密的連接在一起［2］。研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈的木質(zhì)纖維素極難被分解。這是由于玉米秸稈韌皮部的木質(zhì)素含量很高，木質(zhì)素化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，導致一般微生物很難降解木質(zhì)素并分解內(nèi)部的纖維素［3］。因此，在對玉米秸稈木質(zhì)纖維素的生物降解過程中，降解木質(zhì)素是關(guān)鍵。

毛頭鬼傘（Coprinus comatus） 屬于傘菌目（A-garicales） 鬼傘科 （Psathyrellaceae） 鬼傘屬 （Coprinus），因其子實體未開傘、形似火雞腿，故又稱為雞腿菇，是一種白腐類蕈菌［4］。Ward G.等［5］的研究表明，白腐類蕈菌對木質(zhì)素利用沒有選擇性，能夠同時降解木質(zhì)素、纖維素、半纖維素，可充分利用秸稈中木質(zhì)纖維素并且釋放大量代謝能量。劉朝貴等［6］用稻草為主要培養(yǎng)基原料，栽培毛頭鬼傘，研究稻草對毛頭鬼傘胞外酶活性的影響。結(jié)果表明，毛頭鬼傘在菌絲體生長時期主要利用漆酶，子實體生長時期主要利用纖維素酶。

秸稈木質(zhì)素的生物降解主要以漆酶為木質(zhì)素降解酶［7］，纖維素的降解主要依靠羧甲基纖維素酶，半纖維素的降解主要依靠木聚糖酶［8］。研究發(fā)現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基中加入芳香類化合物染料，其能與酶類發(fā)生顯色或褪色現(xiàn)象，可判斷食用菌能否產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶及產(chǎn)酶能力的強弱［9］。本試驗選取5株不同來源的毛頭鬼傘菌株，通過平板篩選和酶活性檢測等方法，比較其分解玉米秸稈木質(zhì)纖維素的能力，旨在篩選降解玉米秸稈能力較強的菌株?？蔀樯锝到?、循環(huán)利用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈資源提供較好的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株具體情況見表1。

表1 試驗菌株Tab.1 Test strain

1.1.2 供試玉米秸稈

玉米秸稈原料采自天津農(nóng)學院靜海良種廠試驗地。在烘箱內(nèi)105℃下殺青2 h，然后80℃烘干至恒重。自然冷卻后用粉碎機粉碎，過60目篩備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。

PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：在1 000 mL PDA培養(yǎng)基上加入0.4 mL愈創(chuàng)木酚。

無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基［10］：KH2PO41.0 g、CaCl20.5 g、 CoCl21.7 mg、 FeSO45 mg、（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 MnSO4·7H2O 1.6 mg、ZnCl21.7 mg、瓊脂20 g，超純水1 000 mL。

產(chǎn)纖維降解酶液［11］：KH2PO41.0 g、CaCl20.013 g、K2HPO40.4 g、NH4NO30.5 g、VB10.002 5 g、玉米秸稈粉10 g，超純水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈的初篩

1）毛頭鬼傘菌株降解纖維素平板試驗

將保藏的毛頭鬼傘供試菌株，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上活化，長滿后用打孔器在平板上制出菌塊。將微晶纖維素（2.0 g） 加入1 000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制成以纖維素為唯一碳源的固體培養(yǎng)基平板。將菌塊置于固體培養(yǎng)基的中心，23.5℃下培養(yǎng)，每個菌株做3個重復(fù)。從菌絲萌發(fā)起，每隔24 h用直尺測量菌落直徑，取平均值。

2）毛頭鬼傘菌株降解木質(zhì)素平板試驗

本試驗采用愈創(chuàng)木酚顯色法，對5個毛頭鬼傘菌株進行漆酶顯色反應(yīng)試驗，將制備好的菌塊接種到PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基平板中心，23.5℃下培養(yǎng)，每個菌株3個重復(fù)。從菌絲萌發(fā)起，每隔24 h進行觀察，分別測量菌落和變色圈的直徑。

3）毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈平板試驗

將玉米秸稈粉（10 g） 加入1 000 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制成以玉米秸稈為碳源的固體培養(yǎng)基平板。試驗方法同上。

1.2.2 液體培養(yǎng)毛頭鬼傘產(chǎn)纖維降解酶的試驗

1）不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)纖維降解酶培養(yǎng)試驗

將初篩中選出的3個毛頭鬼傘菌株，制備菌塊。接入產(chǎn)纖維降解酶液，于23.5℃、150 r·min-1的搖床中培養(yǎng)，從第4天起每隔2 d取樣檢測其所產(chǎn)漆酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的酶活性，3次重復(fù)。

2）漆酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶酶活力的測定

粗酶液制備：取10 mL種子液于離心管中，4℃下4 000 r·min-1離心20 min，取上清液。

漆酶酶活性測定：向96孔板中加入0.15 mL的50 mmol·L-1的醋酸鈉緩沖液，50 μL稀釋10倍的粗酶液，0.1 mL的1 mmol·L-1ABTS，以蒸餾水作為對照，使用酶標儀測定436 nm處5 min內(nèi)的光吸收值的變化。

羧甲基纖維素酶測定：將1.5 mL的羧甲基纖維素鈉溶液（用pH 5.0的50 mmol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制）和0.5 mL的粗酶液，加入25 mL刻度試管中，40℃水浴保溫30 min。取出后立即加入3 mL DNS試劑，煮沸10 min后冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻。用酶標儀測定540 nm處的吸光值，以煮沸滅活30 min的酶液作為對照。

木聚糖酶活性測定：將0.9 mL的櫸木木聚糖溶液（用pH 5.0的50 mmol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制） 和0.1 mL的粗酶液加入25 mL刻度試管中，40℃水浴保溫30 min。取出后立即加入3 mL DNS試劑，煮沸10 min后冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻。用酶標儀于540 nm處測吸光值，以煮沸滅活30 min的酶液作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈的初篩

2.1.1 毛頭鬼傘菌株降解纖維素能力比較

不同毛頭鬼傘菌株降解纖維素能力比較情況見圖1。

由圖1所示，5個毛頭鬼傘菌株在以微晶纖維素為碳源的平板培養(yǎng)基上均可生長，其中長勢較好的菌株為1號菌株、2號菌株、4號菌株，在培養(yǎng)的第7天，其菌落直徑分別達到6.95 cm、6.73 cm、6.26 cm；5號菌株長勢最差，在第7天菌落直徑為5.74 cm。

圖1 不同毛頭鬼傘菌株以微晶纖維素為碳源的生長情況Fig.1 Growth of different strains of Coprinus comatus using microcrystalline cellulose as carbon source

2.1.2 毛頭鬼傘菌株降解木質(zhì)素能力比較

毛頭鬼傘菌株主要通過漆酶對木質(zhì)素進行降解。漆酶可以和愈創(chuàng)木酚反應(yīng)，具有漆酶活性的菌株菌落周圍會呈陽性反應(yīng)，形成紅棕色顯色圈，且顯色圈直徑、顏色深淺可以有效反應(yīng)漆酶活性大小［7］。具體結(jié)果見表2。

表2 不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)漆酶能力比較Tab.2 Comparison of the laccase production abilities of different strains of Coprinus comatus

從表2中可以看出，5個毛頭鬼傘菌株在愈創(chuàng)木酚平板上均呈紅棕色，發(fā)生顯色反應(yīng)，表示都具有產(chǎn)生漆酶的能力。PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基的變色圈和菌落直徑會隨著培養(yǎng)時間不斷增長，變色圈顏色的深淺和菌落直徑的大小均存在差異，其中2號菌株、1號菌株、4號菌株變色圈直徑較大、變色程度較深，菌絲生長較快。5號菌株變色圈最小，菌絲生長速度慢。

2.1.3 毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈能力比較

不同毛頭鬼傘菌株以秸稈為碳源生長的情況見圖2。

圖2 不同毛頭鬼傘菌株以秸稈為碳源的生長情況Fig.2 Growth of the different strains of Coprinus comatus using straw as carbon source

從圖1和圖2可以看出，5個毛頭鬼傘菌株在以秸稈為碳源的平板培養(yǎng)基上的生長狀況比在微晶纖維素平板好，1號菌株、2號菌株、4號菌株在第7天，菌落直徑就達到了7.75 cm、7.31 cm、6.92 cm。這是由于玉米秸稈中的營養(yǎng)成分比微晶纖維素復(fù)雜和豐富，除了含纖維素還有其他碳源和營養(yǎng)物質(zhì)［12］。綜上所述，在培養(yǎng)的第6天，1號菌株、2號菌株、4號菌株在微晶纖維素平板、秸稈平板、PDA-愈創(chuàng)木酚平板上，菌落的生長情況均優(yōu)于3號菌株和5號菌株。

2.2 液體培養(yǎng)毛頭鬼傘產(chǎn)纖維降解酶能力比較

利用平板試驗中篩選出的3株（1號、2號、4號），具有較強降解木質(zhì)纖維素能力的毛頭鬼傘菌株，在以玉米秸稈為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過比較玉米秸稈降解過程中羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶的酶活性，進一步判定毛頭鬼傘菌株對玉米秸稈的降解能力。

2.2.1 毛頭鬼傘菌株產(chǎn)羧甲基纖維素酶酶活性的比較

不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)羧甲基纖維素酶酶活性的比較情況見圖3。

圖3 不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)羧甲基纖維素酶活性的比較Fig.3 Comparison of the activity of carboxymethyl cellulase produced by different strains of Coprinus comatus

羧甲基纖維素酶是降解纖維素的相關(guān)酶類，由圖3所示，3個毛頭鬼傘菌株在整個液體培養(yǎng)周期中均具有羧甲基纖維素酶酶活性，且隨著培養(yǎng)時間的延長，羧甲基纖維素酶酶活性不斷變化。在培養(yǎng)初期3個菌株的羧甲基纖維素酶酶活性均較低，隨著培養(yǎng)時間的延長，酶活性逐漸升高，在第10天到達峰值，第12天開始下降。其中2號菌株的羧甲基纖維素酶酶活性最高，達到4.05 U·mL-1，高于其他2個菌株，1號菌株和4號菌株的羧甲基纖維素酶酶活性均在3.30 U·mL-1左右。

2.2.2 毛頭鬼傘菌株產(chǎn)木聚糖酶酶活性的比較

不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)木聚糖酶酶活性的比較情況見圖4。

圖4 不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)木聚糖酶酶活性的比較Fig.4 Comparison of the xylanase activity produced by different strains of Coprinus comatus

木聚糖酶是降解半纖維素的酶類，通過圖4可見，3個毛頭鬼傘菌株的木聚糖酶酶活性趨勢大致相同，在培養(yǎng)6 d內(nèi)，木聚糖酶酶活性水平一直較低，隨后迅速升高，在培養(yǎng)的第10天達到最大值，在第12天有所下降。培養(yǎng)的第10天，1號菌株酶活性最高達到42.36 U·mL-1，其次是2號菌株，菌株酶活性為40.65 U·mL-1，4號菌株最低，酶活性為38.27 U·mL-1，3個菌株木糖酶酶活性均較高。

2.2.3 毛頭鬼傘菌株產(chǎn)漆酶酶活性的比較

漆酶是降解木質(zhì)素的主要酶類，不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)漆酶酶活性的比較情況見圖5。

圖5 不同毛頭鬼傘菌株產(chǎn)漆酶活性的比較Fig.5 Comparison of the laccase activity of different strains of Coprinus comatus

如圖5所示，3個毛頭鬼傘菌株的酶活表現(xiàn)一致，均呈逐漸上升然后下降的趨勢，在培養(yǎng)的第10天達到最大值，第12天酶活性下降。其中1號菌株漆酶酶活性最高，為10.39 U·mL-1，其次是2號菌株，漆酶酶活性為9.89 U·mL-1，4號菌株最低，漆酶活性為 9.37 U·mL-1。

3 結(jié)論

毛頭鬼傘降解玉米秸稈平板試驗中，通過5株毛頭鬼傘菌株在玉米秸稈、微晶纖維素為唯一碳源的平板培養(yǎng)基，以及作為指示劑檢測漆酶含量的PDA-愈創(chuàng)木酚平板培養(yǎng)基上的生長情況，可以初步判定1號菌株、2號菌株、4號菌株具有較強的產(chǎn)木質(zhì)素、纖維素相關(guān)酶類，以及降解木質(zhì)素和纖維素的能力。

利用平板中篩選出的3個毛頭鬼傘菌株，在以玉米秸稈為唯一碳源的液體培養(yǎng)基進行酶活力測定試驗。結(jié)果表明，3個菌株的酶活性變化較一致，培養(yǎng)初期，3個菌株所產(chǎn)酶的酶活性均較低，酶活性從培養(yǎng)的第4天開始逐漸升高，在第10天時酶活性達到峰值，12 d后開始逐漸下降。其中1號菌株的木聚糖酶酶活性最強，在培養(yǎng)的第10天木聚糖酶酶活性達到42.36 U·mL-1，這可能是由于半纖維素成分復(fù)雜而誘導產(chǎn)生多種半纖維素酶［13］。并且1號菌株在培養(yǎng)的第8天漆酶活性達到了8.84 U·mL-1，這是因為毛頭鬼傘作為白腐類蕈菌，具有分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素的能力［14］，所以漆酶在前期增長速度高于其他2種酶，由此可見1號菌株分泌木聚糖酶、漆酶能力均強于其他菌株。通過試驗結(jié)果可以看出，毛頭鬼傘菌株能夠產(chǎn)生大量的木質(zhì)素降解酶，能夠降解秸稈中外層的木質(zhì)素，促進秸稈內(nèi)部纖維素和半纖維素的降解，從而充分利用秸稈中的木質(zhì)纖維素，這與孫江慧的研究結(jié)果相一致［15］。綜上所述1號菌株具有降解玉米秸稈的優(yōu)勢，可為生物降解、循環(huán)利用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈資源提供較好的依據(jù)。