綠原酸對變形鏈球菌抑制作用的體外實驗研究*

陳昱敏，許斯華，張 澤，劉錦婷，顧 瑜，白國輝

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)口腔醫(yī)學(xué)系，廣東 珠海 519041;2.貴州省高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點實驗室，貴州 遵義 563000)

齲病是人類的常見病及多發(fā)病，是世界范圍內(nèi)的一種重要的公眾健康問題[1]，而變形鏈球菌(Streptococcus mutans) 是公認(rèn)的導(dǎo)致齲病最主要的致病菌[2]，通常以菌斑生物膜的形式存在，粘附于牙齒表面，并持續(xù)產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦，最終形成齲壞，因此抑制變形鏈球菌可達(dá)到預(yù)防齲壞的目的。

漱口是常用的自我菌斑控制方法，目前在口腔臨床常用的具有抗菌能力的漱口液大多以抗生素、乙醇等為功能成分[3],長期使用易引起抗藥性、菌群失調(diào)、黏膜刺激等問題。因此,尋找有效、安全、并且可長期使用的天然防齲藥物作為漱口液已經(jīng)成為控制菌斑的研究重點。

基于此背景，越來越多的學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向中草藥。在我國,中草藥資源豐富、運用歷史悠久，許多藥物如茶多酚、魚腥草等因其具備殺菌消炎作用且毒副作用小而廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究以及臨床實踐。姜東等研究表明，金銀花提取物綠原酸能夠?qū)Σ煌逍偷淖冃捂溓蚓戤a(chǎn)生抑菌或殺菌作用[4]。

本實驗探究綠原酸對變形鏈球菌的抑菌效果，并希望將綠原酸作為主要成分制備一種新型漱口水。

1 材料與方法

1.1菌種來源本實驗供試細(xì)菌變形鏈球菌由貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室提供。

1.2材料來源BHI 購自舜友(上海)生物技術(shù)有限公司， 按標(biāo)準(zhǔn)方法配成 BHI 培養(yǎng)基。綠原酸(批號 JS90022)由上海金穗生物科技有限公司公司提供，綠原酸純度≥98%，用無菌水配成相應(yīng)濃度的藥液，現(xiàn)配現(xiàn)用。氯己定漱口水購自深圳南粵藥業(yè)有限公司，含氯己定1.2%。

1.3方法

1.3.1制備菌懸液復(fù)蘇變形鏈球菌菌種，將其接種于BHI平板培養(yǎng)基上，37 ℃于厭氧條件下培養(yǎng) 24 h；用革蘭染色法鑒定為變形鏈球菌后，挑取單菌落在培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增，24 h 后檢測其密度,比濁法測定濁度，調(diào)密度至1×108CFU·mL-1,再通過培養(yǎng)液將菌懸液密度稀釋至 1×107CFU·mL-1。

1.3.2抑菌實驗用無菌水將綠原酸配置為不同質(zhì)量濃度的溶液，根據(jù)文獻(xiàn)中[5]綠原酸對于不同菌種的最小抑菌濃度設(shè)計濃度梯度為 0.5、0.625、1.0、 1.25、2.0、2.5、4.0、5.0 mg·mL-1。將滅菌干燥后的無菌濾紙片浸泡于不同濃度的溶液中，用無菌鑷子取出浸泡后的紙片，瀝干，貼于均勻涂布有變形鏈球菌的平板上，每個平皿貼 5 片，并設(shè)置陽性對照組(氯己定漱液)、 陰性對照組(無菌水)。每片紙片間隔距離≥24 mm，紙片中央與平皿邊沿間隔距離≥15 mm。貼好紙片后，置平板于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后取出，用卡尺精確測量，記錄紙片周圍抑菌圈大小。重復(fù)實驗3次，取平均值。以上實驗操作均在超凈工作臺中進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析, 選用單因素方差分析的Dunnett T3 檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度綠原酸對變形鏈球菌生長的影響綠原酸濃度為0.5 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1的溶液對變形鏈球菌的抑菌圈直徑均與陰性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中溶度為0.625 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的綠原酸溶液對變形鏈球菌的抑菌圈直徑,與陰性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 綠原酸抑制變形鏈球菌的抑菌圈直徑

3 討 論

綠原酸(Chlorogenic acid)即3-咖啡酰寧酸，廣泛分布于植物界中，其作為金銀花中的主要功能性有機(jī)酸，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等多種效用。 金銀花(Flos Lonicerae)是一種常用的中藥材，目前已被用來開發(fā)多種治療呼吸道感染、肺炎、風(fēng)疹的藥物，如銀翹解毒片、雙黃連制劑等[6]。

柴貝貝等研究表明，綠原酸在與抗菌藥聯(lián)用后，大部分能增強(qiáng)魚源鏈球菌對抗菌藥的敏感性[7]；陳昶等研究發(fā)現(xiàn)綠原酸能夠抑制變形鏈球菌的糖基轉(zhuǎn)移酶活性，降低其對蔗糖的黏附能力[8]。同時，有研究表明，綠原酸能夠破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，對引起齲病的變形鏈球菌、放線粘桿菌及引起牙周病的產(chǎn)黑色素類桿菌、牙齦炎桿菌、伴放線嗜血菌等均顯示較強(qiáng)的抑菌活性[5]。還有研究者將綠原酸作為防腐劑添加至化妝品中，發(fā)現(xiàn)在膏霜內(nèi)加入一定量的金銀花葉提取物，在未添加其他任何防腐劑的條件下， 能夠在半年內(nèi)有效地抑制細(xì)菌生長，因此證明金銀花葉提取物具有防腐抗菌的作用[9]。

本實驗采用濾紙片法，測定變形鏈球菌在不同濃度綠原酸溶液作用下的抑菌圈大小。從測得的結(jié)果來看，綠原酸溶液濃度為5.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1時，對變形鏈球菌均能夠產(chǎn)生抑制作用。氯己定作為臨床常用的漱口水制劑，具有抗菌消炎的作用，本實驗中濃度為0.625 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1的綠原酸溶液，其抑菌效果與氯己定比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

綠原酸作為一種天然藥物，不良反應(yīng)較少，口感醇和，長期使用氯己定等漱口液制劑導(dǎo)致的味覺改變等癥狀[10]，在使用綠原酸時均能夠避免。因此，本實驗通過研究綠原酸對變形鏈球菌的抑菌作用，希望將其作為一種新型漱口水的主要成分，應(yīng)用于人們的日常生活中，用于現(xiàn)代各種口腔疾病(齲病、牙周病等)的預(yù)防。