腫瘤3D細(xì)胞模型在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

劉艷紅， 李 靜， 余孝其， 王 娜， 劉 媛， 張 驥

(四川大學(xué)a.基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心;b.化學(xué)學(xué)院，成都610064)

0 引言

國家“雙創(chuàng)”政策的推行對(duì)高校人才培養(yǎng)提出了新的要求。如何扭轉(zhuǎn)傳統(tǒng)教學(xué)中“唯分?jǐn)?shù)論”的教學(xué)評(píng)價(jià)體系，形成以培養(yǎng)創(chuàng)新思維、激發(fā)內(nèi)源性創(chuàng)新動(dòng)力為目標(biāo)的人才培養(yǎng)體系，是高校教學(xué)改革的重要方向［1］。高校本科實(shí)驗(yàn)作為學(xué)生探索、實(shí)踐的重要載體，在培養(yǎng)學(xué)生以“解決問題”為導(dǎo)向的批判性、創(chuàng)新性思維中發(fā)揮著重要作用。在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，不斷改進(jìn)舊的實(shí)驗(yàn)體系，逐步減少驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的數(shù)量，增加“以問題”為導(dǎo)向的綜合型、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的比重，是“雙創(chuàng)”環(huán)境下，本科實(shí)驗(yàn)改革和發(fā)展的方向。本文以腫瘤個(gè)體化治療的需求為依據(jù)，以建立體內(nèi)外治療效果一致的模型為目標(biāo)，設(shè)計(jì)了一個(gè)創(chuàng)新型本科實(shí)驗(yàn)。

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升，手術(shù)聯(lián)合化療藥物治療依然是腫瘤治療的主要手段［2］。但由于個(gè)體間存在差異，同一種分化類型的腫瘤在不同個(gè)體中表現(xiàn)出不同的藥物敏感性［3］。因此，在體外建立與體內(nèi)治療效果一致且操作簡(jiǎn)單、易于評(píng)價(jià)的藥敏檢測(cè)方法是改善腫瘤化療效果，提高腫瘤治愈率，實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)體化治療的重要途徑?；谀[瘤個(gè)體化治療的需求，結(jié)合最新的科研成果，將3D腫瘤細(xì)胞模型應(yīng)用于體外藥敏檢測(cè)。通過該實(shí)驗(yàn)的開設(shè)鼓勵(lì)學(xué)生關(guān)注不同學(xué)科的研究進(jìn)展，提高學(xué)生運(yùn)用前沿的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、分析方法解決實(shí)際問題的能力。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

學(xué)習(xí)并掌握腫瘤3D細(xì)胞模型的培養(yǎng)方法;了解體外藥敏實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法;理解并掌握化療藥物敏感性的評(píng)價(jià)方法。提高學(xué)生查閱文獻(xiàn)、獲取信息、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的能力;加強(qiáng)學(xué)生對(duì)體外不同細(xì)胞模型的認(rèn)知。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

3D細(xì)胞培養(yǎng)是近年來化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域一項(xiàng)重要的新技術(shù)，與傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，該模型中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)更接近于在體細(xì)胞中的狀態(tài)，可以反映細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，在一定程度上重現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展的過程［4-5］。目前，該模型已經(jīng)應(yīng)用于體外藥物篩選、生物安全性評(píng)價(jià)、腫瘤浸潤遷移等方面的研究［6-10］。3D細(xì)胞球是一種簡(jiǎn)單的3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)［11］，主要采用懸滴法和低黏附培養(yǎng)法培養(yǎng)［12］。該細(xì)胞模型操作簡(jiǎn)便、大小可控、重復(fù)性好、易于大量培養(yǎng)，適合開發(fā)為本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)。

體外藥敏檢測(cè)采用ATP生物熒光法(ATP-TCA)。該方法是體外藥敏檢測(cè)中靈敏度較高、穩(wěn)定性較好、操作最簡(jiǎn)便的一種方法［13］。ATP-TCA法是通過對(duì)活細(xì)胞中的ATP進(jìn)行定量檢測(cè)，用ATP的含量反映活細(xì)胞的數(shù)量。其檢測(cè)原理為:ATP是活細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)指標(biāo)，在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ATP的含量穩(wěn)定不變，但是，當(dāng)細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP可迅速降解。熒光素酶在有氧條件下，與熒光素結(jié)合，催化ATP轉(zhuǎn)化成AMP，同時(shí)釋放出熒光，熒光的強(qiáng)度與ATP含量呈正相關(guān)。因此，可以通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度反映活細(xì)胞的數(shù)量［14］。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

瓊脂糖、DMEM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清和 Live/Dead Cell Imaging Kit，美國賽默飛世爾科技公司;CellTiter-Glo3D Cell Viability Assay，美國Promega公司;甲基纖維素，美國Amresco公司;5-氟尿嘧啶(5-FU)和紫杉醇(PTX)為原料藥，北京Solabio公司;氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀均為國產(chǎn)分析純。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

化學(xué)-熒光發(fā)光儀，美國賽默飛世爾科技公司;LSM 780共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司;TS-100型倒置顯微鏡，日本尼康公司;二氧化碳培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司;超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10% 胎牛血清和1%青-鏈霉素混合液。人肺癌細(xì)胞 A549用含10% 胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到90%以上時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 3D 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2和A549細(xì)胞分別消化成單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。然后，用含0.24% 甲基纖維素的完全培養(yǎng)基將HepG2細(xì)胞懸液稀釋至1×105個(gè)/mL，A549細(xì)胞的密度調(diào)整為1.5×105個(gè)/mL，混合均勻后將其滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上，每滴25 μL，內(nèi)蓋反扣蓋好后放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，將內(nèi)蓋上已形成的多細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至瓊脂糖(質(zhì)量體積比為1%)預(yù)包被的96孔板中，每孔一個(gè)細(xì)胞團(tuán)，單孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞球的直徑約為500 μm時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 化療藥物體外藥敏檢測(cè)

根據(jù)化療藥物5-FU和PTX在動(dòng)物體內(nèi)的血漿峰值濃度(PPC)配制200×母液，其中，5-FU的 PPC為160 μg/mL，PTX 的 PPC 為 54 μg/mL［15］。實(shí)驗(yàn)前，吸去96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，每孔100 μL。將藥物按照 8×PPC、4×PPC、2 ×PPC、1 ×PPC、0.5 ×PPC、0.25 ×PPC、0.125 × PPC 和 0.0625 ×PPC加入96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物作用48 h后，每孔加入100 μL ATP檢測(cè)試劑，室溫震蕩5 min后，再放置25 min，然后采用化學(xué)-熒光發(fā)光儀進(jìn)行讀數(shù)。

1.4.4 藥物敏感性評(píng)價(jià)

采用Origin 8.5軟件計(jì)算化療藥物每個(gè)濃度對(duì)3D腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，計(jì)算方法如下:

其中:X為藥物組8個(gè)復(fù)孔的平均發(fā)光值;M1為未加細(xì)胞和藥物的對(duì)照組8個(gè)復(fù)孔的平均發(fā)光值;M0為未加藥物對(duì)照組8個(gè)復(fù)孔的平均發(fā)光值。

計(jì)算出一系列不同濃度的化療藥物對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞球的抑制率后繪制抑制曲線，并計(jì)算不同藥物的IC50值和IC90值。按 Kurbacher［16］、翁春梅等［14］的標(biāo)準(zhǔn)判定腫瘤對(duì)化療治療藥物的敏感性。

1.4.5 Live/Dead 細(xì)胞成像分析

化療藥物5-FU和PTX按照PPC濃度作用HepG2 3D細(xì)胞48 h后，采用Live/Dead細(xì)胞雙色染色法進(jìn)行染色，染色方法參考說明書。將Live Green和Dead Red試劑等比例混合，配制成2×工作液，然后等體積加入到待檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中，室溫孵育15 min后，通過激光共聚焦成像進(jìn)行分析?；罴?xì)胞成像的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm和515 nm，死細(xì)胞成像的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為570 nm和602 nm。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，藥敏檢測(cè)結(jié)果用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 體外藥敏檢測(cè)結(jié)果

3D腫瘤細(xì)胞球?qū)熕幬?-FU和PTX的藥物敏感性結(jié)果如圖1所示?；熕幬?-FU在低濃度時(shí)即表現(xiàn)出明顯的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用，其中，對(duì)A549細(xì)胞球的抑制作用明顯強(qiáng)于HepG2細(xì)胞［圖1(a)］。作為抑制微管解聚類藥物，PTX可以有效地抑制兩種細(xì)胞球的生長(zhǎng)，且半數(shù)抑制濃度IC50值均小于PPC值。PTX 對(duì) HepG2 細(xì)胞球的IC50為 1.48 μg/mL，是 PTX PPC濃度的2.7%，PTX對(duì) A549細(xì)胞球的IC50值為9.91 μg/mL，是 PPC 的18.3%。與5-FU 不同，PTX 對(duì)HepG2細(xì)胞球的抑制作用明顯強(qiáng)于A549細(xì)胞［圖1(b)］。按照 Kurbacher等［16］對(duì)化療藥物敏感性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。A549 3D細(xì)胞模型對(duì)兩種化療藥物均表現(xiàn)出中度敏感，而HepG2 3D細(xì)胞模型對(duì)化療藥物PTX中度敏感，對(duì)5-FU不敏感。

2.2 Live/Dead細(xì)胞成像結(jié)果

由于活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇透過性，一些熒光染料無法進(jìn)入活細(xì)胞，被排除在活細(xì)胞之外。利用活細(xì)胞和死細(xì)胞膜通透性的不同，實(shí)驗(yàn)采用雙色熒光染色的方法對(duì)HepG2 3D細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果如圖2所示。5-FU作用3D細(xì)胞48 h后，細(xì)胞球內(nèi)部出現(xiàn)少量紅色熒光著色細(xì)胞，但是細(xì)胞球的結(jié)構(gòu)依然致密，表明5-FU對(duì)HepG2 3D細(xì)胞具有一定的殺傷作用。PTX作用48 h后，3D細(xì)胞球結(jié)構(gòu)變得疏松，出現(xiàn)大量零散的細(xì)胞團(tuán)，紅色熒光著色細(xì)胞量增加，顯示 PTX對(duì)HepG2 3D細(xì)胞具有明顯的毒性。該結(jié)果與體外藥敏檢測(cè)結(jié)果一致。

圖1 5-FU和PTX對(duì)3D細(xì)胞球生長(zhǎng)的抑制曲線

表1 兩種腫瘤3D細(xì)胞球?qū)熕幬锏拿舾行?/p>

圖2 雙色熒光染色顯示活細(xì)胞和死細(xì)胞

圖2中A和B為共聚焦成像后的三維重構(gòu)圖，a和b為3D細(xì)胞球橫向和縱向的截面圖(注:圖中標(biāo)尺所示為 100 μm)。

本實(shí)驗(yàn)在體外建立了應(yīng)用于化療藥物敏感性檢測(cè)的3D腫瘤細(xì)胞模型，結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞球?qū)熕幬颬TX中度敏感，對(duì)5-FU不敏感。A549細(xì)胞球?qū)熕幬颬TX和5-FU中度敏感。

3 教學(xué)效果分析

(1)以“解決問題”為導(dǎo)向，改革實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，激發(fā)學(xué)生的內(nèi)在動(dòng)力。以“問題”為導(dǎo)向，設(shè)計(jì)創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，鼓勵(lì)學(xué)生查閱文獻(xiàn)，并結(jié)合已掌握的專業(yè)知識(shí)，創(chuàng)造性地解決實(shí)際問題，可以激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的動(dòng)力。本實(shí)驗(yàn)以解決“在體外建立與體內(nèi)效果一致的藥敏檢測(cè)體系”為目標(biāo)，設(shè)計(jì)了一個(gè)創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，鼓勵(lì)學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獨(dú)立分析和解決問題，在實(shí)踐中培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、善于分析的能力，激發(fā)學(xué)生敢于突破、勇于創(chuàng)新的內(nèi)在動(dòng)力。

(2)將先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法引入本科實(shí)驗(yàn)，拓展學(xué)生的知識(shí)視野。3D細(xì)胞培養(yǎng)是一種新的細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)單層細(xì)胞培養(yǎng)的不足，是單層細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型連接的有效橋梁［4］。目前，3D細(xì)胞模型已經(jīng)成為科學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)。將該實(shí)驗(yàn)方法引入，向?qū)W生介紹最前沿的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，打通了科研與教學(xué)的壁壘，增加了學(xué)生對(duì)學(xué)科前沿的了解。

(3)通過創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，培養(yǎng)學(xué)生的批判性、創(chuàng)新性思維。體外藥敏檢測(cè)方法有多種，如何選擇適用于3D細(xì)胞球的檢測(cè)方法，需要在實(shí)踐中去嘗試和探索。目前，已報(bào)道的ATP-TCA法主要應(yīng)用于單層細(xì)胞模型的檢測(cè)，該方法的靈敏度很高，最低檢測(cè)限為幾百個(gè)細(xì)胞。通過與其他細(xì)胞活力檢測(cè)方法的比較發(fā)現(xiàn)，該方法同樣適用于較小細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞活力的檢測(cè)。另外，該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好，且檢測(cè)時(shí)間短，因此，選用ATP-TCA法檢測(cè)3D細(xì)胞球的細(xì)胞活力。通過以“問題”為導(dǎo)向?qū)嶒?yàn)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)，在實(shí)踐中訓(xùn)練學(xué)生獲取信息、分析歸納、探索總結(jié)的能力，并逐步培養(yǎng)學(xué)生的批判性、創(chuàng)新性思維。

4 結(jié)語

“培養(yǎng)創(chuàng)新精神，激發(fā)內(nèi)在創(chuàng)新動(dòng)力”是“雙創(chuàng)”政策的核心思想，也是對(duì)高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系改革的要求。在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，加大以“問題”為導(dǎo)向的創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目比例有利于學(xué)生創(chuàng)新思維的培養(yǎng)?！澳[瘤3D細(xì)胞模型在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用”是以解決腫瘤個(gè)體化治療中的實(shí)際問題為導(dǎo)向，以最新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和分析方法為主要內(nèi)容的一個(gè)創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，也是“雙創(chuàng)”環(huán)境下的一次重要的嘗試。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目已經(jīng)取得了階段性的成果，還需要在推廣中不斷地完善。而這種以解決問題為導(dǎo)向，以緊跟學(xué)科前沿的先進(jìn)方法、先進(jìn)技術(shù)為實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開發(fā)將有助于高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革和創(chuàng)新人才培養(yǎng)。