苦莪潔陰凝膠配方提取物聯(lián)合黃柏提取物的抗菌作用初探

李定祥 蔣利利 劉桂杰 張杰*

苦莪潔陰凝膠由苦參、莪術(shù)、蒼術(shù)及冰片四味藥組成，具有行氣破瘀、燥濕殺蟲、生肌止痛之功效，藥效學(xué)研究［1］表明苦莪潔陰凝膠對(duì)婦女常見致陰道炎細(xì)菌、真菌均有明顯的體外抑菌作用。近年來臨床病例顯示金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌等是婦女細(xì)菌性陰道炎的常見致病菌［4-6］。為了增強(qiáng)苦莪潔陰凝膠的療效，本實(shí)驗(yàn)以上述常見致病菌為菌株，通過比較苦莪潔陰凝膠配方提取物中加入不同比例黃柏提取物后的抗菌活性，來探析兩者聯(lián)合使用后的協(xié)同作用，以指導(dǎo)尋找更有效的治療陰道炎的中藥配方。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 樣品：苦莪潔陰凝膠配方提取物（批號(hào)：171201）和黃柏提取物（批號(hào)：180101），由貴陽新天藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)菌種：金黃色葡萄球菌菌株（MU50），金黃色葡萄球菌菌株（USA300），大腸埃希菌菌株（AB1157），綠膿桿菌菌株（PAO1）。大腸LB 培養(yǎng)基，葡萄球菌TSB培養(yǎng)基。

1.3 儀器設(shè)備 超凈臺(tái)和37℃恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋電子有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 去離子水，無菌蒸餾水，乙醇，鹽酸，氨水，10%硅鎢酸試劑，活性炭，氯化鈉，強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。

1.5 方法 （1）苦莪凝膠配方提取物制備方法：苦參提取物：取苦參藥材（苦參堿、氧化苦參堿總量＞1.2%），分別加10倍量水煎煮三次，1h/次，濾過，合并濾液，減壓濃縮，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)75%，靜置冷藏24h，濾過，濾液減壓回收乙醇，加鹽酸調(diào)pH2～3，靜置12h，濾過，濾液通過已處理好的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱，加完藥液后，以去離子水繼續(xù)洗脫至水洗脫液pH 6～7，棄去水洗液；加濃氨水浸泡2h，再以10%的氨水液洗脫，以10%硅鎢酸試劑檢查至沉淀反應(yīng)陰性為止，收集洗脫液，減壓回收至無氨味，加水至350ml，加入活性炭，加熱煮沸后保持微沸30min，趁熱濾過，濾液濃縮成浸膏，并干燥至固體。莪術(shù)、蒼術(shù)揮發(fā)油制備：取莪術(shù)、蒼術(shù)，粉碎成粗顆粒，加8倍量水蒸餾提取6h，收集餾出液，加入氯化鈉使含鹽量達(dá)15%，冷藏12h，分取上層油液（揮發(fā)油成分），備用。（2）黃柏提取物：黃柏藥材（小檗堿含量＞3.0%），采用水加熱提取、醇沉的方法，制成黃柏提取物。（3）試驗(yàn)藥物：取苦參提取物25.2g，加入揮發(fā)油0.2464ml，冰片0.7g，共計(jì)26.15g，得苦莪凝膠配方提取物（A）。取黃柏提取物5.0g，得B。然后將A與B按表1中的比例配制成各試驗(yàn)組藥物，編碼1-5#（見表1）。（4）最低抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)方法：分別稱取試樣1-5#于無菌試管中，以無菌蒸餾水稀釋10倍。加熱培養(yǎng)基至約80℃，吸取5ml培養(yǎng)基于試管中，吹吸數(shù)次以溶解凝膠，然后傾注細(xì)菌培養(yǎng)基平板，各平板含藥終濃度以倍釋法稀釋。用生理鹽水稀釋各菌種，比濁法配制成15×105CFU/ml菌液。取各菌液接種環(huán)（約10μl）分別接種于含不同濃度試樣或空白樣的各培養(yǎng)基上，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌置普通溫箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。同樣方法將各菌接種于不含試樣的相應(yīng)培養(yǎng)基內(nèi)并培養(yǎng)。

表1 試驗(yàn)藥物配制及濃度

2 結(jié)果

觀察各培養(yǎng)基上各細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以完全無菌生長(zhǎng)的試樣最高稀釋度為該試樣的MIC。與1#苦莪凝膠配方提取物比較，加入黃柏提取物后，提高了針對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果2～8倍；黃柏提取物針對(duì)金黃色葡萄球菌效果優(yōu)于其它菌株（見表2）。

表2 試驗(yàn)藥物最小抑菌濃度MIC

3 討論

在正常狀態(tài)下，構(gòu)成陰道感染的正常菌群有20 多種微生物，各種菌群之間相互制約、相互協(xié)調(diào)，共同構(gòu)建陰道微生態(tài)平衡。由于受到自身或外部環(huán)境的影響導(dǎo)致陰道菌群紊亂，從而引發(fā)陰道炎癥。伍宗惠等［5］報(bào)道了386例陰道炎陰道菌群紊亂患者的病原菌分布情況，通過培養(yǎng)、分離共檢出433株病原菌，其中革蘭陽性菌252株（58.20%），革蘭陰性菌113株（26.10%），真菌68株（15.70%）。其中包括革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌28株（6. 47%），革蘭陰性菌大腸埃希菌46株（10. 62%）。此外，袁秀蘭等［6］對(duì)非淋球菌性陰道炎患者細(xì)菌感染檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，860 份陰道分泌物標(biāo)本中558份有病原菌生長(zhǎng)，共分離得到653 株細(xì)菌，其中單株菌感染398 例，多重感染160 例，檢出率64.88%（558/860）。革蘭氏陽性球菌的檢出率30.17%（197/653），主要為金黃色葡萄球菌（95株，14.55%）、化膿鏈球菌、糞腸球菌及溶血葡萄球菌。革蘭氏陰性球菌的檢出率69.83%（456/653），主要為大腸埃希菌（111株，17.00%）、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌及洛菲不動(dòng)桿菌。因此本實(shí)驗(yàn)選擇臨床菌株金黃色葡萄球菌MU50、USA300和Newman、大腸埃希菌AB1157以及綠膿桿菌（PAO1）作為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行抗菌活性篩選。

已有臨床研究報(bào)道［2］，苦莪潔陰凝膠治療細(xì)菌性陰道病濕熱下注證的中醫(yī)證候療效明顯優(yōu)于安慰劑；苦莪潔陰凝膠與復(fù)方甲硝唑栓比較，治療細(xì)菌性陰道病濕熱下注證，在細(xì)菌性陰道病消除率、綜合療效、中醫(yī)證候療效等方面兩者均無明顯差異。黃柏，習(xí)稱“川黃柏”，為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chiltense Schneid．的干燥樹皮。具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，是臨床常用的清熱燥濕藥。黃柏的主要化學(xué)成分為小檗堿、黃柏堿等生物堿類成分，具有抗菌、消炎等藥理作用［3］。為了更好的提高苦莪潔陰凝膠的臨床療效，本實(shí)驗(yàn)欲研究苦莪潔陰凝膠提取物與黃柏提取物是否具有協(xié)同增效作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦莪潔陰凝膠提取物加入黃柏提取物后，針對(duì)金葡菌的MIC顯著降低，抗菌能力成倍增加，說明苦莪合用黃柏有協(xié)同增效作用，該研究為開發(fā)更有效的治療細(xì)菌性陰道炎的中藥配方提供了可靠依據(jù)。