caspase-7/12與兒童原發(fā)性EBV感染肝損傷的相關(guān)性研究

胡玲瓏 王菊香 周海霞 李原

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是非嗜肝病毒感染引起兒童肝損害的常見病原體，原發(fā)性急性EBV感染可導(dǎo)致82%的患兒出現(xiàn)肝功能損傷［1］，大部分患兒的癥狀會(huì)在治療1周內(nèi)減退［2］。目前對(duì)EBV感染導(dǎo)致肝功能損傷的機(jī)制尚未完全明確。探索EBV感染后機(jī)體內(nèi)與肝功能損害分子的表達(dá)情況，將為EBV感染導(dǎo)致肝功能損傷的防治提供新的思路和策略，有助于闡明EBV感染誘導(dǎo)肝功能損傷的內(nèi)在分子機(jī)制。Caspase7/12是導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的主要分子蛋白，但是否與原發(fā)性EBV感染導(dǎo)致的肝功能損傷存在相關(guān)性，目前尚未明確。本課題通過收集患兒肝功能數(shù)據(jù)，并采用ELISA法檢測(cè)患兒血液中肝細(xì)胞損傷相關(guān)分子蛋白的表達(dá)，探索原發(fā)性EBV感染肝功能損害與caspase7/12表達(dá)變化的相關(guān)性及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至12月在本院住院治療的原發(fā)性EBV感染患兒236例，EBV-IgM檢測(cè)均為陽(yáng)性，其中伴有肝功能損傷的162例為肝功能異常組，分別檢測(cè)其急性期及恢復(fù)期實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，恢復(fù)期抽血時(shí)間為住院治療第7天，肝功能正常的74例為肝功能正常組，年齡1～14歲；肝功能異常組按年齡再分為4個(gè)亞組，包括幼兒組（1～3周歲）37例，學(xué)齡前組（4～6周歲）41例，學(xué)齡組（7～10周歲）35例，青少年組（11～14周歲）49例。收集相關(guān)的肝功能數(shù)據(jù)。標(biāo)本采集獲得患者或家屬知情同意，本研究通過本院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 ELISA方法檢測(cè)血清caspase-7/12蛋白的表達(dá)水平 Caspase-7/12ELISA試劑盒為美國(guó)PeproTech公司生產(chǎn)；抗Caspase-7/12抗體購(gòu)自英國(guó)abcom公司提供。取caspase-7/12酶聯(lián)免疫試劑盒，室溫下靜置30 min，每孔加50μl標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測(cè)樣品，留2孔為空白對(duì)照孔；塑料薄膜覆蓋微孔板，孵育2h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標(biāo)板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔加50μl生物素標(biāo)記的抗caspase-7/12抗體，塑料膜封板，孵育2h；洗板4次，反轉(zhuǎn)酶標(biāo)板，拍干各孔剩余的洗滌液；每孔依次序加入顯色劑A和顯色劑B，避光室溫孵育30 min；加入反應(yīng)終止液100μl，自動(dòng)酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定各孔的光密度（OD）值；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品所測(cè)OD值確定其濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)采用雙變量相關(guān)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能異常組和肝功能正常組以及肝功能異常組急性期和恢復(fù)期各肝功能指標(biāo)比較 肝功能異常組谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）數(shù)值明顯高于肝功能正常組（P＜0.001）；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和總膽紅素（TBLL）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝功能異常組中急性期和恢復(fù)期進(jìn)行比較ALT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。

表1 肝功能異常組中急性期與恢復(fù)期ALT、AST和TBLL的比較（x±s）

2.2 肝功能異常組中各年齡分組間ALT差異比較 青少年組ALT與其它各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），余指標(biāo)在各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 肝功能異常組中各年齡組ALT、AST和TBLL的比較（x±s）

2.3 肝功能異常組和肝功能正常組間caspase-7/12比較 見表3。

表3 肝功能異常組和肝功能正常組間caspase-7/12比較（x±s）

2.4 肝功能異常組急性期和恢復(fù)期caspase-7/12比較 見表4。

表4 肝功能異常組急性期和恢復(fù)期caspase-7/12比較

2.5 肝功能異常組中各年齡組間caspase-7/12比較 肝功能異常組中按年齡分4個(gè)亞組，只有青少年組的caspase-7/12與其它組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），余各組之間的caspase-7/12兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表5）。

表5 肝功能異常組中各年齡組caspase-7/12的表達(dá)水平比較（x±s）

2.5 肝功能異常組急性期和恢復(fù)期caspase-7/12與ALT相關(guān)性分析 肝功能異常組中急性期caspase-7/12的表達(dá)水平與ALT存在線性相關(guān)（r=0.965，P＜0.001）（見圖1）。

圖1 肝功能異常組急性期ALT與caspase-7/12的相關(guān)性分析

3 討論

EBV是臨床上最為常見的導(dǎo)致兒童肝損傷的非嗜肝病毒，屬4型皰疹類病毒。肝功能損傷是原發(fā)性EBV感染最為常見的并發(fā)癥之一，但EBV感染如何導(dǎo)致肝損傷，其病理生理機(jī)制目前尚未完全明確。新的國(guó)內(nèi)研究表明，EBV感染與乙肝病毒感染誘導(dǎo)的肝損傷存在相似性，可能與B淋巴細(xì)胞活動(dòng)存在某種協(xié)同作用［3］；Zekri在研究臨床丙肝時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果EBV感染處于活動(dòng)期，患者的轉(zhuǎn)氨酶升高明顯［4］；在2000年時(shí)有研究揭示EBV感染可以激活機(jī)體免疫能力相關(guān)的因子，進(jìn)而導(dǎo)致各臟器損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞的凋亡［5］。

在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的整個(gè)過程中，細(xì)胞內(nèi)caspase系列蛋白酶的激活起著重要作用。目前已經(jīng)明確的凋亡通道有三種，分別是caspase-8參與傳遞的細(xì)胞外信號(hào)凋亡通路，caspase-9參與介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以及caspase-12參與誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，在這三條caspase參與介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，最后都需經(jīng)過caspase-7 起效應(yīng)［6］。眾多臨床實(shí)驗(yàn)的研究文獻(xiàn)提示在肝炎患者中，肝細(xì)胞的損傷一般表現(xiàn)為凋亡的過程，并且和caspase系列蛋白分子依賴的細(xì)胞凋亡過程緊密相關(guān)，其中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的caspase-7/12作用最為顯著，在一些研究乙肝、丙肝的臨床實(shí)驗(yàn)文章中，絕大部分患者血清中caspase-7/12的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯升高［7-8］，Masuoka HC在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過使用caspase抑制劑來(lái)治療丙肝，取得了顯著的效果［9］，但caspase-7/12與原發(fā)性EB病毒感染誘導(dǎo)的肝功能損傷是否存在內(nèi)在的相關(guān)性，目前尚未完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性EBV感染患兒血清中 caspase-7的表達(dá)水平明顯上升，且肝功能異常組中ALT、caspase-7/12的表達(dá)水平明顯高于肝功能正常組。既往在對(duì)丙肝的研究提示在肝炎患者中caspase-7/12表達(dá)水平的上升可直接誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致肝功能的損傷，而采用caspase的抑制劑后，caspase-7/12表達(dá)下降，部分患者肝功能恢復(fù)正常。在肝功能異常組患兒中，急性期患兒的caspase-7/12以及ALT表達(dá)水平明顯高于恢復(fù)期患兒，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)EBV感染后，急性期caspase7/12的表達(dá)與ALT的升高存在線性相關(guān)，提示原發(fā)性EBV感染所致肝功能的損傷與caspase7/12之間存在密切的內(nèi)部聯(lián)系。同時(shí)根據(jù)年齡分組，青少年組的caspase-7/12以及ALT表達(dá)水平明顯高于其它3組，與香港兒童EBV感染導(dǎo)致肝功能損傷的研究中發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)肝功能的損害越明顯的結(jié)果一致［10］。

因此，caspase-7/12的高表達(dá)與兒童原發(fā)性EBV感染所致的肝功能損害密切相關(guān)，同時(shí)ALT的升高與caspase-7/12的表達(dá)水平存在線性相關(guān)。