超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中6種氨基糖苷類(lèi)藥物殘留

鐘名琴，黃 婷，吳雯娟，羅 燕*，丁燕玲

（1.深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000）

氨基糖苷類(lèi)藥物（AGs）是一類(lèi)含有氨基糖苷鍵的廣譜性抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性[1]。近年來(lái)，由于其高效、低價(jià)，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域中常用于治療細(xì)菌感染病，以亞劑量給藥預(yù)防疾病。此外，在畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也常添加到飼料中促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，以提高飼料利用。AGs對(duì)動(dòng)物組織具有很強(qiáng)的親和力，給藥后多天仍可在動(dòng)物體中檢測(cè)出藥物殘留，長(zhǎng)期高劑量使用藥物會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生蓄積毒性，甚至通過(guò)食物鏈作用傳遞或其他渠道攝入人體中，對(duì)人體和動(dòng)物造成危害，產(chǎn)生腎毒性、聽(tīng)力減退、耳鳴或耳部飽滿(mǎn)感等耳毒性和神經(jīng)肌肉阻滯等[2-3]。為保障食品安全，歐盟明確規(guī)定禁止使用AGs作為畜禽促生長(zhǎng)添加劑，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）及許多國(guó)家和機(jī)構(gòu)明確規(guī)定了該類(lèi)藥物在食品中的最大殘留限量要求。我國(guó)也加強(qiáng)了對(duì)動(dòng)物源性食品中該類(lèi)藥物的殘留監(jiān)控，如農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)規(guī)定鏈霉素/雙氫鏈霉素在肌肉中的最大殘留限量為600 μg·kg-1。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)該類(lèi)抗生素的方法主要有微生物法、分光光度法、免疫分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[4-8]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測(cè)該類(lèi)抗生素應(yīng)用較廣泛的方法[9-12]。動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法大多檢測(cè)周期長(zhǎng)，樣品前處理過(guò)程繁瑣，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，甚至需要衍生化處理等，這給目標(biāo)物的快速定性、準(zhǔn)確定量檢測(cè)帶來(lái)較大困擾。

本試驗(yàn)對(duì)樣品前處理方法和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立具有高靈敏度、高選擇性的UPLC-MS/MS法同時(shí)快速準(zhǔn)確定性、定量檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B等6種氨基糖苷類(lèi)藥物。該方法操作簡(jiǎn)便，能大幅縮短檢測(cè)周期，靈敏度高，還能有效避免七氟丁酸等離子對(duì)試劑造成的儀器污染及離子抑制等問(wèn)題，為動(dòng)物源性食品中氨基糖苷類(lèi)藥物監(jiān)控提供快速、準(zhǔn)確可靠的定性和定量技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀、配有電噴霧（ESI）離子源的AB Sciex Triple Quad TM 5500質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）、N-EVAP-24型全自動(dòng)氮吹儀、IKA旋渦混合器、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3-30KS離心機(jī)、Milli-Q Integral3型超純水儀、奧特賽斯AS系列超聲波清洗機(jī)、Waters HLB（6cc 200 mg）固相萃取柱。

1.1.2 藥品與試劑

甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、異丙醇（色譜純）、三氯乙酸（分析純）、氨水（優(yōu)級(jí)純）等。

鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素、潮霉素B：純度高于90.0%，均為德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

1.2 樣品制備

取適量新鮮豬肉組織，充分絞碎且均質(zhì)，于-20℃避光保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素、潮霉素B的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用水溶解并稀釋成濃度為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光保存6個(gè)月。再分別移取適量上述各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用（AGs易吸附于玻璃制品上，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量使用塑料制品）。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)均質(zhì)的豬肉樣品2.0 g（精確至0.01 g），置于50.0 mL離心管中，加入5%三氯乙酸溶液5 mL，渦旋30 s，于水平振蕩器上振蕩提取15 min，9 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。再加入5 mL 5%三氯乙酸溶液重復(fù)操作1次，合并上清液，用甲酸或氨水調(diào)節(jié)pH為6.5±0.5，備用，凈化前9 000 r·min-1離心5 min。

1.4.2 凈化

取全部上清液10.0 mL以1滴·3 s-1流速過(guò)依次用5 mL甲醇和3 mL水活化的HLB固相萃取柱（規(guī)格：6cc 200 mg），用水3 mL淋洗，減壓抽干。再以流速1滴·3 s-1用甲酸/異丙醇/水溶液2 mL（10∶5∶85，v/v/v）洗脫入塑料離心管中，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動(dòng)相A為甲酸銨溶液200 mmol（pH 3）；流動(dòng)相B為乙腈（色譜純）；柱溫40.0℃；進(jìn)樣體積5.0 μL。具體梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：550℃；氣簾氣壓力：35.0 psi；碰撞氣壓力：9 psi；霧化器壓力：55.0 psi；輔助加熱器壓力：55.0 psi。

保留時(shí)間、定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量見(jiàn)表2?？瞻谆|(zhì)分別添加1 000 μg·kg-1鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B藥物的色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 空白樣品中添加1 000 μg·kg-1氨基糖苷類(lèi)藥物的色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱(chēng)取6個(gè)空白豬肉樣品經(jīng)上述樣品前處理方法處理，獲得空白樣品提取液。分別用空白樣品提取液配制鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素混合外標(biāo)濃度為50.0、100.0、300.0、500.0、1 000.0和1 500.0 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)曲線及潮霉素B外標(biāo)濃度為100.0、300.0、500.0、1 000.0、1 500.0和2 000.0 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B基質(zhì)試驗(yàn)峰面積與相應(yīng)回收濃度的線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)分別為0.992 7、0.994 2、0.997 4、0.997 8、0.998 1、0.998 7，見(jiàn)表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白豬肉樣品為基質(zhì)，做7個(gè)平行添加試驗(yàn)，鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素的陽(yáng)性添加濃度均為20.0 μg·kg-1，潮霉素B陽(yáng)性添加濃度為100 μg·kg-1，按照上述樣品前處理方法全過(guò)程進(jìn)行預(yù)處理和測(cè)定，平行樣本n=7。根據(jù)各樣本檢測(cè)值計(jì)算出平均值X及標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，按公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X（k為置信因子，一般取3）計(jì)算，鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B檢測(cè)限分別為5.3、6.9、6.5 、2.9、4.1和1.7 μg·kg-1，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 方法回收率和精密度驗(yàn)證

用空白基質(zhì)樣品分別對(duì)鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素進(jìn)行20.0、100、500 μg·kg-1及潮霉素 B 進(jìn)行 100、200、1 000 μg·kg-13個(gè)水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平取6個(gè)平行樣，按1.2.3中的方法進(jìn)行處理，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。其平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液線性參數(shù)

表4 方法加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

續(xù)表4

由表4可知，該方法的回收率較好，鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B的回收率范圍分別為80.6%～96.9%、93.8%～102.0%、72.4%～104.0%、84.8%～99.5%、80.6%～99.0%和78.8%～97.9%，方法檢出限低、重復(fù)性好、定性可靠、定量準(zhǔn)確，能穩(wěn)定提取豬肉中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B，并且峰形受基質(zhì)的干擾比較小。

3 結(jié)論

本方法建立了動(dòng)物肌肉組織中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢出限低、回收率較好、靈敏度高。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程及儀器參數(shù)，該方法簡(jiǎn)單、快捷、易操作，可大幅縮短檢測(cè)時(shí)間和節(jié)約人力物力，能有效消除基質(zhì)干擾，適用于動(dòng)物肌肉組織中鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、壯觀霉素和潮霉素B的準(zhǔn)確定性、定量檢測(cè)。