ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)白念珠菌抑菌活性及機(jī)制研究

余甜 時(shí)文靜 謝躍 李可可 鄒鳳梅 劉剛 李軍春 張興旺 魏蓮花,*

(1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；2 寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；3 甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，蘭州 730000)

白念珠菌(Candida albicans)，又稱(chēng)白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界，多寄生于人體皮膚、黏膜、口腔，上呼吸道以及陰道等部位，正常情況下酵母相在顯微鏡下呈圓形或者橢圓形，與機(jī)體處于共生狀態(tài)，屬于機(jī)會(huì)性致病菌。近年來(lái)，隨著艾滋病、惡性腫瘤患者的增多，導(dǎo)尿管或靜脈置管及內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)的開(kāi)展，高效廣譜抗生素、器官移植術(shù)后免疫移植抑制劑、以及激素的應(yīng)用等多種因素，真菌感染已經(jīng)是臨床不能忽視的重要問(wèn)題，而白念珠菌為代表的念珠菌病是其中的熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。生物膜是白念珠菌一個(gè)重要致病因子。研究表明，與浮游細(xì)胞相比，生物膜形成的基質(zhì)-胞外多聚化合物(EPS)具有強(qiáng)大的屏障作用，因而對(duì)抗菌劑耐藥性更強(qiáng)[2]。ε-聚賴(lài)氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是天然抗菌物質(zhì)，對(duì)許多細(xì)菌和真菌均有較好的抑制作用，但關(guān)于ε-PL對(duì)白念珠菌的抑制作用文獻(xiàn)幾乎沒(méi)有報(bào)道[3]。本研究以白念珠菌為研究對(duì)象，測(cè)定ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)白念珠菌的抑菌活性，以及對(duì)白念珠菌生物膜抑制作用，初步探究其抑菌機(jī)制，為臨床抗真菌藥物的研發(fā)提供新思路。

1 材料

1.1 菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC64548和ATCC64550)由甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存，50株臨床菌株由甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心從陰道、糞便、痰、肺泡灌洗液等標(biāo)本中分純，使用質(zhì)譜儀鑒定為白念珠菌，紙片法-80℃保存。

1.2 試劑

ε-聚賴(lài)氨酸(鄭州拜納佛生物工程股份有限公司)，沙保弱培養(yǎng)基(英國(guó)，Oxoid)、RPMI1640液體培養(yǎng)基(美國(guó)，Gibco)，結(jié)晶紫染料(珠海迪爾生物工程有限公司)，酵母菌提蛋白試劑盒(上海生工)，活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒(萬(wàn)類(lèi)生物)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(萬(wàn)類(lèi)生物)，BCA總蛋白測(cè)定試劑盒(索萊寶)。

1.3 設(shè)備

德國(guó)布魯克(MALDI-TOF)飛行質(zhì)譜儀，酶標(biāo)儀(瑞士Sunrise)，紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技有限公司)，熒光顯微鏡(日本，Olympus)。

2 方法

2.1 MIC和MFC測(cè)定

采用CLSI-M27文件中微量稀釋法測(cè)定抗真菌藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌(ACTT22019)，使用酶標(biāo)儀讀取MIC值[4]，以真菌抑制百分?jǐn)?shù)為80%的最小濃度孔為真菌的MIC。將MIC實(shí)驗(yàn)中每株菌的不同孔培養(yǎng)混合物涂布在沙保弱培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48h后無(wú)菌落形成的最小藥物濃度即為最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration, MFC)。

2.2 SMIC50測(cè)定

使用結(jié)晶紫染色法篩選白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC64548和ATCC64550)和50株臨床中具有生物膜形成能力的菌株。在篩選出具有生物膜能力菌株中隨機(jī)抽取16株臨床菌株以及1株標(biāo)準(zhǔn)菌株，進(jìn)行SMC50測(cè)定實(shí)驗(yàn)。SMIC50測(cè)定方法參考馮凡等[5]實(shí)驗(yàn)方法制備生物膜模型后，分別在實(shí)驗(yàn)孔和空白對(duì)照孔加入藥液和培養(yǎng)基，37℃，75r/min震蕩培養(yǎng)48h后，干燥固定后結(jié)晶紫染色3h，蒸餾水沖洗直至無(wú)色，干燥2h后每孔150μL加入30%冰醋酸，待其完全溶解后測(cè)A590值。生物膜抑制百分?jǐn)?shù)為50%的最小濃度孔為真菌的SMIC50。

2.3 浮游菌株時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)和生物膜時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)

浮游菌株時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)：將保存的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC64548和ATCC64550)活化后，使用RPMI1640將其稀釋成2×106CFU/mL，然后稀釋100倍使其濃度變成2×104CFU/mL，將菌懸液中加入不同濃度ε-PL，37℃，200r/min 震蕩培養(yǎng)，分別在不同時(shí)間點(diǎn)吸取各體系中100μL液體，加入96孔板中測(cè)定吸光度A590值，并繪制時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

生物膜時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)：將保存的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC64548和ATCC64550)使用“2.2”項(xiàng)方法制備生物膜模型后，加入100μL的RPMI 1640培養(yǎng)基和100μL不同濃度的ε-PL，37℃，75r/min震蕩培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定生物膜形成情況(方法同“2.2”項(xiàng))，并繪制時(shí)間生物膜抑制-時(shí)間曲線(xiàn)[6]。

2.4 ε-PL對(duì)菌絲和芽管抑制作用

將保存的白念珠菌ATCC64548活化后，使用生理鹽水配制為2×106CFU/mL，取菌液500μL加入到含4mL牛血清試管中，再加入不同的濃度藥物500μL，37℃恒溫中200r/min震蕩培養(yǎng)，每隔2h取一接種環(huán)的培養(yǎng)物涂布在玻片上，顯微鏡下觀察并測(cè)定菌絲的長(zhǎng)度及平均值。芽管生長(zhǎng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)芽管形成百分率時(shí)，芽管生長(zhǎng)的長(zhǎng)度超過(guò)菌體直徑2倍以上為正常生長(zhǎng)芽管；芽管長(zhǎng)度低于菌體直徑2倍者，認(rèn)為芽管受抑制。計(jì)數(shù)過(guò)程中使用OLYMPUS顯微鏡系統(tǒng)上測(cè)定有正常生長(zhǎng)芽管長(zhǎng)度，每次3個(gè)人同時(shí)測(cè)定芽管長(zhǎng)度及計(jì)數(shù)[7]。

2.5 測(cè)定ε-PL誘導(dǎo)白念珠菌產(chǎn)生活性氧(ROS)含量

將活化后白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC64548配置成2×106CFU/mL后，取500μL加入到含4mL的RPMI1640培養(yǎng)基中，再加入不同的濃度藥物500μL，37℃恒溫中200r/min震蕩培養(yǎng)12h后，取菌懸液3mL，3000r/min離心10min，收集菌體，用PBS洗滌3次后，將菌體重懸于PBS中，濃度為2×106CFU/mL，取500μL重懸好的菌液，在暗室中加入5μL濃度為1mmol/L的DCFH-DA使終濃度為10μmol/L，渦旋震蕩均勻，于37℃培養(yǎng)孵育2h，每隔3～5min鐘震蕩混勻，使探針和菌體充分混勻。用5000g離心5min，收集菌體，用PBS洗滌1次，收集菌體沉淀后重懸于250μL PBS液中，混勻后取10μL置于玻片上，使用熒光顯微鏡觀察[8]。

2.6 測(cè)定ε-PL對(duì)白念珠菌的脂質(zhì)氧化程度

白念珠菌ATCC64548活化后，使用生理鹽水配置成2×106CFU/mL，將菌株分成A組和B組，A組的處理方法與“2.6”項(xiàng)相同，B組在A組基礎(chǔ)上加入10mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)，將兩組讓37℃200r/min震蕩培養(yǎng)12h后，10000r/min離心5min收集菌體，采用酵母菌提蛋白試劑盒提取總蛋白，然后使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。采用脂質(zhì)氧化(丙二醛，MDA)檢測(cè)試劑盒測(cè)定脂質(zhì)氧化損傷情況，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[8]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MIC和MFC以及SMIC50測(cè)定結(jié)果

ε-PL對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC64548(氟康唑敏感株)、ATCC64550(氟康唑耐藥株)和50株臨床菌株的MIC80和MFC的濃度分別是512和1024μg/mL(表1和圖1)。在篩選具有生物膜形成能力菌株后，對(duì)隨機(jī)抽取的1株標(biāo)準(zhǔn)菌株和16株臨床菌株的生物膜抑制濃度SMIC50也為512μg/mL，此濃度下ε-PL對(duì)生物膜抑制率平均為58%。

表1 ε-PL對(duì)白念珠菌抑菌作用Tab.1 Antibacterial effect of ε-PL on Candida albicans

3.2 時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)及生物膜抑制時(shí)間曲線(xiàn)

用不同濃度ε-PL處理白念珠菌浮游菌株及生物膜，分別測(cè)定浮游菌的A590值及結(jié)晶紫法測(cè)定生物膜厚度，以繪制不同時(shí)間下藥物對(duì)浮游菌株和生物膜的抑制活性。結(jié)果顯示48h的生長(zhǎng)周期中，ε-PL的對(duì)白念珠菌浮游菌株及生物膜均具有明顯抑制作用，抑制效果與藥物濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，并且在氟康唑敏感株和耐藥株之間并無(wú)明顯差異。從兩組圖中可以明顯看出作用時(shí)間在12h前后，白念珠菌的浮游菌株及生物膜均表現(xiàn)出明顯抑制作用(圖2～3)。

3.3 ε-PL對(duì)菌絲和芽管抑制作用

白念珠菌的菌絲是其重要的毒力因子，在致病中發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)白念珠菌的出芽率及4h內(nèi)的芽管長(zhǎng)度衡量ε-PL對(duì)白念珠菌菌絲的抑制作用，并通過(guò)顯微鏡記錄了牛血清培養(yǎng)基中白念珠菌酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變情況[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)表明MIC和MFC濃度下白念珠菌的芽管出芽率及長(zhǎng)度的具有明顯的抑制作用，并且其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)(P＜0.05)；低濃度的ε-PL對(duì)菌絲沒(méi)有明顯抑制作用(P＞0.05)。顯微鏡下4h內(nèi)芽管圖片結(jié)果(圖5)表明，空白組芽管在2h后可見(jiàn)大量菌絲的纏繞，MIC和MFC濃度下出芽率較低，幾乎均呈現(xiàn)酵母相；在4h時(shí)，低濃度組和空白組均出現(xiàn)菌絲，MIC和MFC芽管出芽率依舊保持低水平且芽管長(zhǎng)度較小。

3.4 ε-PL對(duì)白念珠菌的氧脅迫作用

使用熒光探針DCFH-DA測(cè)定白念珠菌與不同濃度的ε-PL在37℃共培養(yǎng)12h后產(chǎn)生ROS的含量，研究ROS的氧化損傷與ε-PL濃度的關(guān)系。不帶熒光的DCFH-DA探針可以自由的進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞膜后被細(xì)胞內(nèi)的脂酶氧化為DCFH。而DCFH探針不能穿透細(xì)胞膜，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS生成有熒光的DCF，通過(guò)測(cè)定熒光的強(qiáng)度衡量ROS含量。如圖6所示，與空白組相比，不同濃度ε-PL作用于白念珠菌后產(chǎn)生的ROS的含量隨著濃度的升高而升高。當(dāng)ε-PL濃度達(dá)到MIC時(shí)，ROS的生成率約占93.7%。

圖1 ε-PL對(duì)白念珠菌抑菌作用熱圖Fig.1 Heat map of antimony effect of gallium-PL on Candida albicans

圖2 不同濃度ε-PL對(duì)白念珠菌的生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ε-PL on the growth of Candida albicans

圖3 不同濃度ε-PL對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ε-PL on biofilm formation of Candida albicans

圖4 不同濃度ε-PL對(duì)白念珠菌芽管長(zhǎng)度(A)和芽管形成率(B)影響Fig.4 Effects of different concentrations of ε-PL on the tube formation rate (A) and tube length (B) of Candida albicans

圖5 不同濃度ε-PL對(duì)白念珠菌酵母-菌絲轉(zhuǎn)化影響Fig.5 Effects of different concentrations of ε-PL on the transformation of Candida albicans yeast-mycelium(×400)

3.5 ε-PL對(duì)白念珠菌脂質(zhì)氧化損傷作用

為了進(jìn)一步研究ROS和白念珠菌的膜氧化損傷的關(guān)系，分別測(cè)定“2.6”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)處理后MDA含量，以及在“2.6”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上加入抗氧化劑NAC后MDA含量。MDA是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，也是白念珠菌膜系統(tǒng)遭受壓力重要標(biāo)志之一。研究表明：不同濃度ε-PL均可引起白念珠菌膜出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷(圖7)。用512μg/mL的ε-PL作用后，MDA含量是對(duì)照組7倍左右。在加入抗氧化劑前，MDA的含量與ε-PL濃度呈正相關(guān)。在加入抗氧化劑后，MDA含量與之前相比明顯下降。

圖6 不同濃度ε-PL作用白念珠菌后ROS含量(×200)Fig.6 ROS Content of Candida albicans after different concentrations of P-PL(×200)

圖7 不同濃度ε-PL作用白念珠菌后MDA含量Fig.7 MDA content in Candida albicans after different concentrations of P-PL

4 討論

近年來(lái)，隨著艾滋病及惡性腫瘤患者的增多，導(dǎo)尿管或靜脈置管及內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)的開(kāi)展，高效廣譜抗生素以及器官移植術(shù)后免疫移植抑制劑和激素的應(yīng)用等多種因素，真菌感染已經(jīng)是臨床不能忽視的重要問(wèn)題，而白念珠菌為代表的念珠菌病是其中的熱點(diǎn)問(wèn)題。從中國(guó)侵襲性真菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHIF-NET)發(fā)布的數(shù)據(jù)來(lái)看(2009—2014年)：白念珠菌(3965株，44.9%)，近平滑念珠菌(1762, 20%)、熱帶假絲酵母(1515.17.2%)分列前3位。我國(guó)的真菌耐藥率高于世界水平：伏立康唑耐藥率顯著上升，耐藥率由19%上升至21.3%；伏立康唑交叉耐藥率從5.8%上升至6%[9]。其中生物膜形成是白念珠菌重要的耐藥原因，也是大部分白念珠菌深部感染出現(xiàn)慢性感染及復(fù)發(fā)的原因。ε-PL是一種天然抗菌肽，由于其廣譜的抗菌活性、無(wú)毒無(wú)味以及穩(wěn)定性高等特點(diǎn)現(xiàn)廣泛應(yīng)用于食品防腐中[10]。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ε-PL對(duì)白色念珠具有明顯抑菌作用，尤其是對(duì)其生物膜形成有顯著抑制作用，通過(guò)ROS和MDA測(cè)定初步證實(shí)ε-PL對(duì)白念珠菌的抑菌活性是通過(guò)氧脅迫發(fā)揮作用。

本研究首先通過(guò)微量稀釋法測(cè)定了白念珠菌MIC和MFC值，發(fā)現(xiàn)ε-PL在512μg/mL是可以抑制白念珠菌生長(zhǎng)，菌懸液涂布法檢測(cè)結(jié)果表明1024μg/mL可完全殺死白念珠菌，因此可以確定其MIC和MFC值分別為512和1024μg/mL。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步繪制了ε-PL對(duì)白念珠菌作用下的時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果表明ε-PL對(duì)白念珠菌的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)，并且在ATCC64548(氟康唑敏感株)和ATCC64550(氟康唑耐藥株)無(wú)明顯差異。SMIC50測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ε-PL在512μg/mL ε-PL下可明顯抑制生物膜的形成，這表明ε-PL對(duì)生物膜的抑制作用較為顯著。曾貝妮[11]在舒洛地爾對(duì)白念珠菌生物膜抑制作用研究中表明SMIC50濃度通常在浮游菌株MIC濃度的3～4倍，相比之下ε-PL對(duì)生物膜的抑制作用具有明顯優(yōu)勢(shì)。通過(guò)繪制生物膜時(shí)間-抑制曲線(xiàn)表明ε-PL對(duì)生物膜的抑制作在后12h即可發(fā)揮明顯的抑制作用。菌絲是白念珠菌重要的毒力因子，不僅是白念珠菌生物膜的重要組成部分芽，也是其發(fā)揮致病作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中，通過(guò)對(duì)其芽管形成率、芽管長(zhǎng)度、以及酵母-菌絲相轉(zhuǎn)化等方面的考量，結(jié)果表明ε-PL在MIC和MFC濃度下，對(duì)白念珠菌的芽管形成率有顯著的抑制作用(P＜0.05)。在液態(tài)培養(yǎng)基中，ε-PL白念珠菌的酵母-菌絲轉(zhuǎn)化也具有明顯抑制作用。

現(xiàn)階段關(guān)于ε-PL機(jī)制研究中絕大多數(shù)研究者認(rèn)為ε-PL對(duì)病原體的抑菌作用主要通過(guò)氈毯模型中所描述膜損傷機(jī)制導(dǎo)致菌體死亡[12]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)ε-PL作用于菌體后，白念珠菌內(nèi)ROS含量增長(zhǎng)，這種現(xiàn)象也出現(xiàn)ε-PL作用于大腸埃希菌中，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的其他抗真菌劑通過(guò)促進(jìn)ROS的增多來(lái)發(fā)揮殺菌效果相一致[13-14]。ROS是一類(lèi)高反應(yīng)性的小分子，包含有氧衍生自由基等超氧陰離子(O2-)和羥基自由基(OH-)，或非自由基分子，如過(guò)氧化氫(H2O2)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ε-PL作用白念珠菌后，ROS和MDA含量均隨著ε-PL濃度的增加而增加，在加入抗氧化劑后，MDA含量均出現(xiàn)了顯著下降。推測(cè)ε-PL作用于菌體產(chǎn)生的ROS和菌體膜脂質(zhì)氧化損傷有密切相關(guān)。換言之，ε-PL作用于白念珠菌后導(dǎo)致菌體內(nèi)過(guò)量ROS，ROS對(duì)菌體的細(xì)胞膜脅迫出現(xiàn)丙二醛(MDA)含量的增加。丙二醛可以與白念珠菌內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而改變他們的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征，Bo等[15]也支持這個(gè)觀點(diǎn)。葉若松等[8]在研究ε-PL對(duì)大腸埃希菌機(jī)制研究中，表明-PL誘導(dǎo)大腸埃希菌ROS升高，以及氧脅迫基因oxyR、sodA等基因表達(dá)量上升。Liu等[16]推測(cè)ε-PL作用于白念珠菌產(chǎn)生的大量ROS有可能是誘導(dǎo)菌體凋亡的原因，但是具體的分子機(jī)制還沒(méi)有進(jìn)行研究。

ε-PL具有較高的水溶性、無(wú)毒性、以及穩(wěn)定性等特點(diǎn)，現(xiàn)階段成熟的生物工程制備模式讓其也具有經(jīng)濟(jì)性的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了ε-PL對(duì)白念珠菌具有良好的抑制作用，同時(shí)對(duì)菌絲及生物膜等重要毒力因子具有顯著的抑制作用。同時(shí)初步證實(shí)了ε-PL作用于白念珠菌后增加ROS產(chǎn)生發(fā)揮抑菌作用。