miR-194通過調(diào)控相關(guān)靶向蛋白影響肝癌細胞的增殖和侵襲行為

張 彬 張 瑜

四川省成都市第五人民醫(yī)院肝膽外科 611130

肝細胞癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，術(shù)后伴有不良反應的患者5年生存率只有5%左右[1]。主要原因是晚期肝細胞癌的手術(shù)機會小，術(shù)后復發(fā)率高，導致肝細胞癌患者的治療現(xiàn)狀改善不明顯[2-3]。探討研究肝細胞癌的分子發(fā)病機制是研究臨床治療的熱點方向。miRNA是由20～22個核苷酸組成的非編碼RNA，通過特異性結(jié)合和切割信使RNAs(mRNAs)，抑制mRNA翻譯和脫氨基化來抑制其同源靶基因的表達[4]。miRNA已被認為是惡性腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)因子。miRNA表達的異常調(diào)節(jié)在惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常存在明顯的表達差異[5]。另一方面，miRNA的異常表達與肝癌的發(fā)展相關(guān)[6]。例如，miR-122、mi-26a及miR-195已經(jīng)被鑒定為肝臟中的腫瘤抑制劑，而miR-21和miR-221可以促進肝細胞癌變[7]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化行為的特征是細胞黏附性的喪失，上皮細胞黏附蛋白E-鈣粘著蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的下調(diào)，可以直接干擾影響[8]。據(jù)相關(guān)研究證實，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化行為可直接促進惡性腫瘤進展，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導腫瘤抗藥性的產(chǎn)生[9]。然而，miR-194在肝細胞的進展和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用一直沒有得到很好的驗證。

miR-194在肝臟中的表達差異被發(fā)現(xiàn)很久，但其具體功能機制尚未明確。有研究表明miR-194在腸上皮細分化過程中可以誘導其進展[10]。在本實驗目前的研究中，首先在肝癌組織和肝癌細胞中分析miR-194的表達差異，然后通過調(diào)控鈣粘連蛋白的表達干擾其生物學行為進程，直接影響肝癌細胞的惡性轉(zhuǎn)移行為。

1 材料與方法

1.1 組織標本和細胞培養(yǎng) 在本地醫(yī)院獲得肺癌患者書面知情同意后，采集肝癌組織樣本和癌旁正常組織樣本，本研究獲得醫(yī)學院審查委員會的批準。蠟塊包埋的腫瘤樣品用于免疫組織化學研究。HepG2、Hep3B、SNU398和SNU475肝癌細胞購自中國武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞培養(yǎng)條件：10%胎牛血清補充的改良Eagle培養(yǎng)基，37℃，5%CO2恒溫孵箱中培育。

1.2 PCR實驗 使用mirVana miRNA分離試劑盒從肝癌組織和對照癌旁正常組織中分離總RNA。使用Nano-2000分光光度計測定RNA濃度和純度。反應條件按照cDNA合成試劑盒使用說明進行設置。反應條件：95℃預變性10min、95℃變性15s、60℃退火32s，循環(huán)50次后檢測其溶解曲線，檢測完成后，通過計算機系統(tǒng)自動分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達量。實驗重復3次。miR-194引物序列：5’-GTAGCGGTAGCGGATGCGGAGC-3’(正向)和5’-GGATCTATCCCCTAGCGAGTAGGGC-3’(反向)。

1.3 蛋白質(zhì)印跡測定 使用RIPA緩沖液提取總細胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與一抗(濃度1∶1 000)一起孵育過夜。 隨后，將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測，實驗重復3次。

1.4 劃痕愈合實驗 劃痕愈合實驗通過將肝癌細胞接種到六孔板上進行測定。在肝癌細胞附著于平板并達到100%匯合后，使用無菌吸頭通過匯合單層進行刮擦。觀察細胞遷移到劃痕區(qū)域的細胞距離，并拍攝照片，并且對5個隨機選擇的區(qū)域進行統(tǒng)計分析。實驗重復3次。

1.5 Transwell侵襲實驗 Transwell侵襲實驗檢測肝癌細胞的侵襲能力。在含有0.1%牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基中將肝癌細胞加入到上室中，通過基質(zhì)膠侵入下室的細胞數(shù)量用結(jié)晶紫染色劑染色，并在37℃，5%CO2下孵育24～36h后計數(shù)。觀察細胞侵襲到下層小室區(qū)域的細胞數(shù)目，并拍攝照片，并且對5個隨機選擇的區(qū)域進行統(tǒng)計分析。實驗重復3次。

1.6 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗 裸鼠成瘤實驗：將不同組的2×107的肝癌細胞分別離心，用50μl PBS稀釋重懸待用。10只4周左右的裸鼠，分為miR-194-inhibitor組和NC組，每組5只，將兩組肝癌細胞分別注射入左側(cè)腋下，2周觀察腫瘤形成情況。6周后將腫瘤剝除，將腫瘤組織包埋切片進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有統(tǒng)計分析均使用SPSS17.0(SPSS，Chicago，USA)進行。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計學分析采用Student’st檢驗。 使用Pearson相關(guān)分析來估計CCAT1和miR-410的表達水平之間的關(guān)系。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-194在不同肝癌細胞中的表達水平 通過qPCR實驗檢測miR-194在肝癌組織中的表達情況。qPCR結(jié)果顯示：miR-194在肝癌組織中表達水平明顯高于癌旁正常組織(1.28±0.16 VS 0.37±0.03)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞株中結(jié)果顯示：miR-194在HepG2肝癌細胞中的表達最高，后續(xù)實驗選取HepG2肝癌細胞作為實驗細胞株。見圖1。

圖1 miR-194在肝癌組織和細胞株中的表達情況

2.2 miR-194調(diào)控鈣粘蛋白的表達水平 通過Western blotting實驗檢測miR-194對肝癌細胞中鈣粘蛋白的表達水平的影響。實驗結(jié)果顯示(圖2)：轉(zhuǎn)染了miR-194-inhibitor后，E-Cadherin，N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達水平相比NC組均明顯降低(1.81±0.22 VS 0.52±0.08，2.96±0.39 VS 0.51±0.09，2.06±0.24 VS 1.62±0.22)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明抑制miR-194后可以調(diào)控相關(guān)鈣粘蛋白的表達，從而干擾肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

圖2 miR-194對鈣粘蛋白表達水平的影響情況

2.3 miR-194對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響 劃痕愈合實驗檢測結(jié)果顯示(圖3)，與NC對照組相比，抑制miR-194后72h肝癌細胞的遷移能力得到一定程度的減弱[(82.6±15.3)%VS(29.1±8.2)%]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與NC對照組相比，抑制miR-194后肝癌細胞的侵襲能力得到一定程度的減弱[(332.6±29.4)%VS(136.8±16.4)%]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明抑制miR-194的表達對肝癌細胞的遷移和侵襲運動能力有一定的抑制作用。

2.4 miR-194對肝癌細胞體外成瘤能力的影響 兩組小鼠在肝中的轉(zhuǎn)移灶不明顯，對轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織進行蘇木精—伊紅染色的組織切片。結(jié)果如圖4所示，抑制miR-194的表達后可以在一定程度上降低裸鼠體內(nèi)中腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。表明抑制miR-194的表達可以干擾肝癌細胞的生長發(fā)展進程。

圖3 miR-194對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響

圖4 蘇木精—伊紅染色裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移灶的情況

3 討論

雖然miR-194在肝臟中的高表達情況早已證明，但其相關(guān)功能機制了解不甚清楚。兩項關(guān)于人上皮細胞分化和肝纖維化的研究揭示了miR-194的可能功能行為。因為這兩個過程涉及上皮細胞和間充質(zhì)細胞之間的相互作用或轉(zhuǎn)換，筆者推測miR-194可能在肝上皮細胞中特異性表達并在模仿EMT的分化過程中的調(diào)控作用。進一步確定miR-194在上皮細胞中的一個潛在作用是調(diào)控E-Cadherin和N-cadherin的表達并阻礙EMT期間的鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換。從而使肝癌細胞系中miR-194的表達降低下調(diào)N-cadherin的表達并抑制了細胞的遷移和侵襲過程[11]。另外有相關(guān)研究表明miR-194的過度表達可能會逆轉(zhuǎn)某些細胞情況下的細胞分化狀態(tài)，可能是通過釋放間充質(zhì)細胞中E-鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制[12]。盡管這些結(jié)果并不能在完全意義上證實過程，但是揭示了miR-194在維持腫瘤細胞上皮表型和預防EMT過程中潛在的作用[13-14]。

筆者的研究結(jié)果表明，miR-194可能特異性地抑制E-鈣粘蛋白表達和N-鈣粘蛋白表達，但對Vimentin蛋白沒有直接的影響作用。在臨床情況下，轉(zhuǎn)移性細胞并不總是需要完整的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮作用，因為Vimentin在許多轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達差異不明顯。此外，雖然Vimentin蛋白的喪失被認為是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標志之一，但E-鈣粘蛋白表達和N-鈣粘蛋白可能是通過增強腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移的必需因子[15]。所以如果E-鈣粘蛋白表達和N-鈣粘蛋白的外源表達有明顯差異，無論Vimentin的表達如何，肝癌細胞都能促進遷移和侵襲[16]。此外，有報道認為N-鈣粘蛋白可以促進原發(fā)性肝癌的生長，并對肝癌細胞發(fā)揮抗凋亡作用[17]。因此，miR-194調(diào)控E-cadherin和N-cadherin可能在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要和多方面的作用

綜上所述，miR-194可能通過調(diào)控鈣粘蛋白的相關(guān)表達直接影響肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而直接干擾肝癌細胞的遷移和侵襲行為，本研究結(jié)果表明，miR-194是一種潛在的肝癌上皮細胞的miRNA標記，并且在原發(fā)性肝癌細胞中起著抗轉(zhuǎn)移的作用。 因此，miR-194可能是肝癌的預后和治療的潛在靶標。