凍融循環(huán)對(duì)亞高山森林土壤微生物生物量及群落結(jié)構(gòu)的影響

諶亞 ，賈雨橋，王欣宇，楊萬(wàn)勤，吳福忠，張麗，衛(wèi)芯宇 ，陳子豪，楊玉蓮 ，譚波*

1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)研究所/長(zhǎng)江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站/水土保持與荒漠化防治省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；

2. 綿陽(yáng)師范學(xué)院/生態(tài)安全與保護(hù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621000

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，其主要以地上和地下凋落物、根系分泌物、木質(zhì)殘?bào)w以及動(dòng)物殘骸為碳源，在森林凋落物的分解、土壤肥力的形成與維持、養(yǎng)分循環(huán)與碳氮周轉(zhuǎn)等生態(tài)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用（Schloter et al.，2003；Green et al.，2004）。土壤微生物對(duì)外界環(huán)境的變化極為敏感，其生物量和群落結(jié)構(gòu)變化是土壤特征變化的早期響應(yīng)指標(biāo)（Zelles et al.，1992），被認(rèn)為是比土壤總有機(jī)質(zhì)更可信的環(huán)境變化指示因子（Chen et al.，2008）。

土壤的季節(jié)性?xún)鋈谑侨蛑?、高緯度或高海拔地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的普遍現(xiàn)象（孫輝等，2008），短期的凍融循環(huán)更是季節(jié)性?xún)鋈谶^(guò)程中重要組成部分，其對(duì)土壤微生物的影響可能更為明顯。凍融過(guò)程會(huì)改變土壤結(jié)構(gòu)、破壞土壤團(tuán)聚體和凋落物中微生物及動(dòng)植物殘?bào)w細(xì)胞，但其釋放出的底物和養(yǎng)分又為存活的土壤微生物提供了有效基質(zhì)（Groffman et al.，2001；Herrmann et al.，2002）。普遍認(rèn)為，凍融循環(huán)對(duì)土壤微生物群落的作用機(jī)制可能包括兩方面，（1）凍融的致死作用。冬季土壤凍結(jié)和凍融循環(huán)作用能降低土壤微生物活性甚至將其致死（Urakawa et al.，2014）。（2）養(yǎng)分供應(yīng)不足。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，從土壤團(tuán)聚體和凋落物中釋放出來(lái)的可溶性養(yǎng)分下降，導(dǎo)致微生物生物群落發(fā)生變化（Cleveland et al.，2014；Herrmann et al.，2002）。因此，凍融期間強(qiáng)烈的環(huán)境變化可能極大地影響著土壤微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)。

川西亞高山森林是中國(guó)西部高山林區(qū)的主體，在氣候調(diào)節(jié)、水土保持、水源涵養(yǎng)、生物多樣性保育和全球碳循環(huán)等方面具有不可替代的作用和地位（Yang et al.，2005）。受青藏高原隆起影響，該區(qū)森林土壤每年具有明顯的季節(jié)性?xún)鋈谶^(guò)程（Yang et al.，2007）。凍融循環(huán)研究對(duì)于預(yù)測(cè)全球氣候變化背景下，土壤生態(tài)系統(tǒng)對(duì)凍融特征格局變化的反饋有非常重要的科學(xué)意義，但作為全球氣候變化的敏感區(qū)域，目前有關(guān)亞高山森林土壤微生物對(duì)凍融循環(huán)變化響應(yīng)的研究還較少，這不僅限制了對(duì)亞高山森林土壤微生物群落及亞高山森林生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換過(guò)程的了解，還很難滿(mǎn)足全球變化與區(qū)域響應(yīng)研究的需要。因此，以受季節(jié)性?xún)鋈谟绊懨黠@的川西亞高山森林土壤為研究對(duì)象，采用微縮實(shí)驗(yàn)，模擬凍融循環(huán)對(duì)亞高山森林土壤微生物的影響，以期為深入理解全球變暖背景下亞高山森林生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程對(duì)季節(jié)性?xún)鋈谧兓捻憫?yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)域位于四川省西部，綿陽(yáng)市平武縣王朗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（32°49′－33°02′N(xiāo)，103°55′－104°10′E，海拔2300－4980 m），地處青藏高原與四川盆地的過(guò)渡地帶。該區(qū)域?qū)俚ぐ?松潘半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，干濕季節(jié)差異明顯，年降水量 801－825 mm，主要集中在5－8月，年平均溫度為2.9 ℃，土壤季節(jié)性?xún)鋈谄陂L(zhǎng)達(dá) 5－6個(gè)月。研究區(qū)域內(nèi)優(yōu)勢(shì)喬木為岷江冷杉（Abies faxoniana）、川西云杉（Picea balfouriana）、白樺（Betula platyphylla）、紅樺（Betula albo-sinensis）等，優(yōu)勢(shì)灌木為康定柳（Salix paraplesia）、高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）、缺苞箭竹（Fargesia denudata）等，土壤為棕壤和暗棕壤（Yang et al.，2005；衛(wèi)芯宇等，2018）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017年5月采集供試土壤，在王朗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的針闊混交林、針葉林以及闊葉林內(nèi)分別選取3個(gè)坡向、坡度相近的樣地（表1）。在每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)布設(shè)1個(gè)5 m × 5 m的樣方，收集各樣地內(nèi)的凋落葉，土壤采樣時(shí)，先將土壤表面的凋落物及苔蘚等地被物清理干凈，通過(guò)5點(diǎn)取樣法，以長(zhǎng)寬各為30 cm的方形采集0－10 cm土壤，各林型分別取得 15份樣品，混合均勻后取部分樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除根系和雜質(zhì)，一部分用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)，另一部分過(guò)2 mm篩，存于4 ℃冰箱待用。對(duì)應(yīng)收集各樣地的凋落葉，風(fēng)干備用，同時(shí)取一部分凋落葉測(cè)定其理化性質(zhì)。土壤及凋落葉的理化性質(zhì)詳見(jiàn)衛(wèi)芯宇等（2018）。

表1 樣地的坡度和坡向Table 1 Slope aspect grade of the sampling sites

每個(gè)樣地各稱(chēng)取250 g過(guò)篩新鮮土樣，置于350 mL培養(yǎng)罐中。土壤含水量統(tǒng)一調(diào)節(jié)為60%田間持水量。為了解凍融循環(huán)對(duì)凋落葉分解過(guò)程中土壤微生物群落的影響，模擬表層土原始狀態(tài)，在每一類(lèi)型土壤中添加凋落葉，依據(jù)課題組前期對(duì)該地區(qū)各森林類(lèi)型凋落葉年凋落量的調(diào)查研究（Yang et al.，2006），計(jì)算該地區(qū)單位面積上的實(shí)際凋落葉凋落量，針葉林、針闊混交林和闊葉林分別為 324.4、246.8和 171.2 g·m-2，再根據(jù)培養(yǎng)罐的橫截面積（50.24 cm2）確定凋落葉的添加量，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。本試驗(yàn)添加的針葉林、針闊混交林和闊葉林凋落葉有機(jī)碳含量分別為 348.00、342.86和452.25 g·kg-1（衛(wèi)芯宇等，2018），碳含量差異不顯著，便于進(jìn)行不同林型間研究結(jié)果的比較?；谇捌赪u et al.（2010）的觀(guān)測(cè)數(shù)據(jù)和溫度動(dòng)態(tài)特征，該地區(qū)冬季土壤凍結(jié)時(shí)和土壤融化時(shí)溫度分別長(zhǎng)時(shí)間維持在-5 ℃和5 ℃左右，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在-5 ℃條件下凍結(jié)12 h，5 ℃條件下解凍12 h，能保證土樣凍結(jié)及完全解凍，所以將這樣的一天定義為1個(gè)凍融周期，共80次。用保鮮膜封住培養(yǎng)罐口防止其他雜質(zhì)的輸入，并用針在保鮮膜上扎多個(gè)小孔，保持培養(yǎng)罐內(nèi)外空氣流通。

1.3 樣品采集與分析

分別在凍融循環(huán)培養(yǎng)的第 5、10、20、40、80個(gè)周期取樣并測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。PLFA提取的所有操作均在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。提取過(guò)程參考 Bossio et al.（1998）的方法加以改進(jìn)，進(jìn)行單項(xiàng)萃取。稱(chēng)取(1.00±0.05) g樣品裝入30 mL聚四氟乙烯的棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，依次加入提取液PBS 4.8 mL（磷酸鉀緩沖液，pH 7.4）、甲醇（HPLC）12 mL、三氯甲烷（HPLC）6 mL，渦旋30 s，超聲10 min（37 ℃，100 Hz），37 ℃水浴30 min，冷卻后倒入50 mL廣口三角瓶中，加6 mL三氯甲烷（HPLC）和6 mL PBS，輕輕搖勻后靜置，避光過(guò)夜。吸取下層氯仿相液體，過(guò)0.45 μm孔徑的有機(jī)纖維濾膜，再過(guò)經(jīng)5 mL三氯甲烷（HPLC）活化的硅膠柱。依次用（2 mL×3次）三氯甲烷（HPLC）和（2 mL×3次）丙酮（HPLC）除去非極性磷脂和糖脂。將用甲醇（HPLC）（2 mL×3次）洗脫的極性磷脂用N2吹干，提取物用1 mL堿性甲醇（質(zhì)量濃度為5.6 g·L-1KOH甲醇溶液）和1 mL 甲苯-甲醇溶液（V/V=1∶1）分解，渦旋 30 s，37 ℃水浴30 min，冷卻后用1 mol·L-1乙酸中和，生成的FAMEs（脂肪酸甲酯）再用（2 mL×2次）三氯甲烷-正已烷（V/V為 1∶4）提取，氮?dú)獯蹈?。吹干后的提取物?00 μL三氯甲烷-正已烷（V/V為1∶4）溶解，再用島津QP2010GC-MS分析儀（GC/MS，Model QP-2010，Shimadzu，Japan）檢測(cè)。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析采用磷脂脂肪酸（PLFA）生物標(biāo)記法。PLFA采用標(biāo)準(zhǔn)命名法進(jìn)行分類(lèi)命名，分子式以“X:YωZ(c/t)”表示，其中，X表示脂肪酸分子的碳原子總數(shù)，Y表示不飽和烯鍵數(shù)，ω表示烯鍵距羧基的位置，Z表示烯鍵或環(huán)丙烷鏈的位置；前綴i（iso）和a（anteiso）分別代表順式異構(gòu)和反式異構(gòu)；cy代表環(huán)丙基；Me代表甲基；OH代表羥基；后綴c（cis）和t（trans）分別代表順式和反式同分異構(gòu)（Frosteg?rd et al.，1993）。表征各微生物種群的磷脂脂肪酸標(biāo)記物見(jiàn)表 2，采用各類(lèi)群標(biāo)記物生物量之和，計(jì)算真菌/細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌比值。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

PLFAs為樣品中各類(lèi)微生物的PLFA之和。引入生物多樣性指數(shù)：Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）、Pielou均勻度指數(shù)（J）、Margalef豐富度指數(shù)（SR）和Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）來(lái)分析土壤微生物多樣性。其中，

多樣性指數(shù)：

均勻度指數(shù)：

豐富度指數(shù)：

優(yōu)勢(shì)度指數(shù)：

式中，ni為每種 PLFA的質(zhì)量摩爾濃度，nmol·g-1；N為 PLFA 總質(zhì)量摩爾濃度，nmol·g-1；S為PLFA種類(lèi)數(shù)（常晨暉等，2014）。

運(yùn)用 Excel 2016和 SPSS 20.0（IBM SPSS Statistics，Chicago，IL，USA）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用一般線(xiàn)性模型對(duì)3種林型各指標(biāo)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，單因素方差分析（one-way ANOVA）對(duì)同次取樣不同林型和同林型不同凍融循環(huán)次數(shù)各指標(biāo)進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較（α=0.05）。運(yùn)用 Origin Pro 2018 軟件作圖，Canoco for Windows 5.0分析微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物生物量

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果表明（圖 1），凍融循環(huán)（FTC）對(duì)細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌及真菌 PLFAs含量和真菌/細(xì)菌比值都有顯著影響（P＜0.05）。3種森林土壤中細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的 PLFAs含量呈現(xiàn)隨凍融循環(huán)次數(shù)增加而逐漸降低的趨勢(shì)（圖1a－圖1 c），真菌PLFAs含量和真菌/細(xì)菌比值則隨凍融循環(huán)次數(shù)增加表現(xiàn)出先降低后在第 40次凍融循環(huán)時(shí)升高再降低的趨勢(shì)（圖1d和圖1e），其中真菌/細(xì)菌比值僅闊葉林存在顯著差異（P＜0.05），在第5次凍融循環(huán)時(shí)比值最大，在第 20次凍融循環(huán)時(shí)最低。凍融循環(huán)次數(shù)和林型對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌都無(wú)顯著影響。

單因素方差分析結(jié)果表明，不同林型的土壤細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的PLFAs含量在第5次和第80次凍融循環(huán)時(shí)才有顯著差異（P＜0.05），且混交林顯著高于闊葉林，表現(xiàn)為混交林＞針葉林＞闊葉林?；旖涣帧⑨樔~林和闊葉林第80次凍融循環(huán)的細(xì)菌PLFAs含量分別較第5次低71.9%、73.7%、74.6%，革蘭氏陽(yáng)性菌PLFAs含量分別較第5次低77.1%、68.8%、73.7%（圖1a和圖1b）。各林型的革蘭氏陰性菌和真菌的 PLFAs含量在各個(gè)測(cè)定凍融循環(huán)周期差異都不顯著，混交林、針葉林和闊葉林在第80次凍融循環(huán)的革蘭氏陰性菌 PLFAs含量較第 5次低70.6%、78.1%、78.8%，真菌PLFAs含量較第5次則分別低 55.5%、75.4%、84.7%（圖 1c和圖1d）。

表2 表征特定微生物的PLFA生物標(biāo)記物Table 2 PLFAs used in this study as biomarker

圖1 3種林型土壤微生物群落磷脂脂肪酸質(zhì)量摩爾濃度及比值Fig. 1 Soil microbial PLFAs molality and ratio in three forest types.

2.2 土壤微生物群落多樣性

凍融循環(huán)對(duì) 3種林型的 Margalef豐富度指數(shù)（SR）、混交林和針葉林的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）和 Pielou均勻度指數(shù)（J）及混交林的Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）都有顯著影響（P＜0.05）?；旖涣諷hannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)隨凍融循環(huán)次數(shù)增加而逐漸增加，針葉林和闊葉林均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)則表現(xiàn)出與之相反的變化動(dòng)態(tài)。3種林型的Margalef豐富度指數(shù)整體呈上升趨勢(shì)（圖2）。在第5次凍融循環(huán)時(shí)，混交林的 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)都低于針葉林和闊葉林，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，在第 80次凍融循環(huán)時(shí)，混交林和針葉林的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)都顯著高于闊葉林，而Simpson優(yōu)勢(shì)度的結(jié)果完全相反，表現(xiàn)為混交林和針葉林顯著低于闊葉林?；旖涣值腗argalef豐富度指數(shù)在第5次凍融循環(huán)時(shí)顯著低于針葉林和闊葉林，但隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，各林型間的差異變得不顯著（圖2），說(shuō)明可能隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，土壤微環(huán)境中的土壤微生物種類(lèi)趨于穩(wěn)定。

3種林型5個(gè)凍融循環(huán)周期的指數(shù)相關(guān)性分析表明，多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)相關(guān)系數(shù)為0.913，呈極顯著正相關(guān)，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)與多樣性指數(shù)相關(guān)系數(shù)為0.899，與均勻度指數(shù)相關(guān)系數(shù)為0.921，都呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與豐富度指數(shù)的相關(guān)系數(shù)小于0.5（表3）。由此推測(cè)，微生物多樣性更易受均勻度和優(yōu)勢(shì)度的影響，即與PLFA含量變化有關(guān)，尤其是優(yōu)勢(shì)脂肪酸含量變化對(duì)多樣性指數(shù)影響較大。

表3 不同林型下土壤微生物各指數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Results of correlation analysis of soil microbial indices under different forest types

圖2 3種林型土壤微生物多樣性指數(shù)Fig. 2 Soil microbial diversity index of three forest types

2.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

冗余分析結(jié)果表明，前2軸共同解釋了86.5%的變異，其中第1軸的貢獻(xiàn)值為63.0%（圖3）。土壤環(huán)境因子中，銨態(tài)氮（F=5.3，P=0.008）和硝態(tài)氮（F=4.6，P=0.024）顯著影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮與總微生物量、細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌 PLFAs含量呈顯著正相關(guān)，真菌/細(xì)菌比值與銨態(tài)氮呈正相關(guān)，與硝態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)，革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌比值銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)，與硝態(tài)氮不相關(guān)。

圖3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的冗余分析Fig. 3 Redundancy analysis (RDA) of relationships between soil microbial community structure and soil environmental factors

3 討論

凍融循環(huán)一般通過(guò)改變土壤水分的狀況及分布來(lái)直接影響土壤微生物（DeLuca et al.，1992），其會(huì)對(duì)土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)造成影響，這在亞高山森林土壤中尤為明顯（張麗等，2015）。本研究中，相同林型下細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的 PLFAs含量都隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加而降低，一方面可能是因?yàn)閮鋈谘h(huán)直接致使部分土壤微生物死亡，降低了可培養(yǎng)微生物的多樣性（DeLuca et al.，1992；Walker et al.，2006），另一方面可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)有限的碳源（衛(wèi)芯宇等，2018），使得微生物可利用的分解底物受限導(dǎo)致部分微生物死亡。在培養(yǎng)期間土壤細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的 PLFAs含量都隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加而逐漸降低，而真菌PLFAs含量則在第 40次凍融循環(huán)表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，可能原因是此時(shí)土壤的水分遷移達(dá)到了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，土壤處于新的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定平衡狀態(tài)（王大雁等，2005），真菌群落的耐受性高（Buckeridge et al.，2008），在環(huán)境穩(wěn)定初期取得了生存優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，在第 40次凍融循環(huán)后，各林型的細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的 PLFAs含量隨凍融循環(huán)次數(shù)增加都無(wú)顯著差異（圖1），都表現(xiàn)為混交林＞針葉林＞闊葉林，也可以說(shuō)明此時(shí)凍融循環(huán)狀態(tài)下的土壤微環(huán)境是比較穩(wěn)定的。

不同林型的凋落物物種組成不同，可改善林型的養(yǎng)分狀況，進(jìn)而增加微生物可獲得資源的變異度（陳法霖等，2011），不同種類(lèi)土壤微生物對(duì)這些變化的反應(yīng)可能存在差異（李晶等，2013），導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能之間存在相互影響（Heemsbergen et al.，2004）。在第40次凍融循環(huán)后，混交林的細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌PLFAs含量都高于單一針葉林和闊葉林（圖1），表明與混交林相比，單一針葉林和闊葉林為土壤微生物群落提供生境和食物的能力較低，混交林凋落物更容易被土壤微生物群落利用從而合成自身的生物量，與胡亞林等（2005）的針葉與闊葉混合凋落物的分解能提高了微生物生物量的研究結(jié)果相似。

真菌/細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌的比值常被用作微生物群落整體結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)（Boyle et al.，2008），較大的真菌/細(xì)菌比值表明真菌生物量以及真菌菌絲體增多，與土壤有效養(yǎng)分的接觸面積增大，土壤養(yǎng)分元素的流失減少，因而土壤生態(tài)系統(tǒng)越來(lái)越穩(wěn)定（Franciska et al.，2006）。凍融循環(huán)對(duì)真菌/細(xì)菌比值有顯著影響，且表現(xiàn)為先下降后在第40次凍融循環(huán)升高后降低的趨勢(shì)（圖1e），與真菌PLFAs含量的變化趨勢(shì)一樣，也說(shuō)明在第40次凍融循環(huán)后土壤環(huán)境趨于穩(wěn)定。從圖 1可以看出革蘭氏陽(yáng)性菌PLFAs含量遠(yuǎn)高于革蘭氏陰性菌，Margesin et al.（2009）研究表明革蘭氏陰性菌更易生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤中，而革蘭氏陽(yáng)性菌將在資源受限的土壤中占優(yōu)勢(shì)，較高比例的革蘭氏陽(yáng)性菌是土壤環(huán)境從富營(yíng)養(yǎng)到寡營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)變（張地等，2012），說(shuō)明在一個(gè)無(wú)外來(lái)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的環(huán)境中可利用資源是會(huì)逐漸減少的。

凍融循環(huán)對(duì)3種林型的Margalef豐富度指數(shù)、混交林和針葉林的 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)及混交林的Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)都產(chǎn)生了顯著影響，混交林多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)隨凍融循環(huán)次數(shù)增加而逐漸增加，針葉林和闊葉林均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而優(yōu)勢(shì)度指數(shù)則表現(xiàn)出與之相反的變化動(dòng)態(tài)。3種林型的豐富度指數(shù)整體呈上升趨勢(shì)（圖 2）。頻繁的凍融循環(huán)使微生物群落處于一個(gè)極不穩(wěn)定的狀態(tài)，凋落物受凍融循環(huán)的影響而破碎，剩余只能被部分微生物利用的物質(zhì)為少數(shù)的微生物提供了有效基質(zhì)（Campbell et al.，2005），不穩(wěn)定的環(huán)境使得部分微生物總體數(shù)量減少，而低溫環(huán)境下存活的耐寒微生物一定程度影響了豐富度指數(shù)的變化（李俊等，2016）。嚴(yán)海元等（2010）研究認(rèn)為多樣的凋落物能夠?yàn)槲⑸锾峁┒鄻迂S富的基質(zhì)來(lái)源，因而混合凋落物比單一凋落物有更多適應(yīng)性的微生物存在，所以混交林多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)隨凍融循環(huán)次數(shù)增加而逐漸增加，針葉林和闊葉林均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)與多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。

此外，土壤氮的有效性常常能影響微生物的生長(zhǎng)，環(huán)境中氮有效性越高，微生物的活性越強(qiáng)，繁殖也越快（Craine et al.，2007）。通常地，土壤凍融循環(huán)初期的土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)被破壞（Edwards，1991），大團(tuán)聚體破碎成小團(tuán)聚體，使土壤中原本不可被利用的養(yǎng)分釋放，增加了土壤的可利用養(yǎng)分（李忠佩等，2004；Freppaz et al.，2007）。因此，在第5次凍融循環(huán)后，細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌PLFAs含量最高。然而，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，分解底物逐漸被耗盡，微生物數(shù)量也逐漸減少（孫輝等，2008；張麗等，2015）。這與已有的研究（Freppaz et al.，2007；羅亞晨等，2014；張麗等，2015）以及冗余分析中土壤養(yǎng)分有效性與微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)的結(jié)果一致（圖3）。

4 結(jié)論

凍融循環(huán)對(duì)土壤微生物群落的影響隨林型的不同而存在差異，與5次凍融循環(huán)相比，3種林型的細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的PLFAs含量在經(jīng)過(guò)80次凍融循環(huán)后均出現(xiàn)降低，在第 40次凍融循環(huán)后，土壤微環(huán)境可能處于一個(gè)動(dòng)態(tài)穩(wěn)定平衡狀態(tài)。凍融循環(huán)顯著影響闊葉林的真菌/細(xì)菌比值，林型對(duì)真菌/細(xì)菌比值和革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌比值影響不顯著。凍融循環(huán)對(duì)3種林型的豐富度指數(shù)、混交林和針葉林的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)及混交林的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)都產(chǎn)生了顯著影響，耐寒性強(qiáng)的微生物在凍融循環(huán)作用下更具生存優(yōu)勢(shì)。凍融過(guò)程中土壤養(yǎng)分有效性與微生物群落顯著相關(guān)，全球變暖導(dǎo)致冬季凍融循環(huán)格局變化可通過(guò)改變土壤養(yǎng)分有效性影響亞高山森林土壤微生物生物量和多樣性。