茉莉花MVD基因及其啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)

陳 笛，王鵬杰，鄭玉成，林 浥，鄭知臨，陳桂信，葉乃興

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002)

茉莉花[Jasminum sambac(L.)Ait]為木犀科多年生常綠灌木，既是茶用、香料植物也是藥用植物[1-2].茉莉花植株各組織部位的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類成分及脂肪類、糖苷類、黃酮類、萜類化合物等，均有藥用價(jià)值，其中，萜類化合物在茉莉花揮發(fā)油中廣泛存在，在根和葉中也可檢測到[3-4].在植物中，萜類化合物是通過質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途徑和胞質(zhì)中的甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑合成，而甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(mevalonate pyrophosphate decarboxylase，在已報(bào)道的文獻(xiàn)中簡寫為MDC、MDD、MVD、MPD或DPMDC，本文簡寫為MVD)為MVA途徑上游限速酶中的最后一個(gè)酶，能催化異戊烯基焦磷酸的生成，是一種ATP和Mg2＋的依賴酶，且屬于GHMP激酶超家族[5].目前，MVD基因已從多種植物中分離出來.在靈芝(Ganoderma lucidum)中，其MVD基因的表達(dá)與三萜化合物的含量呈正相關(guān)，并受外源茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)，且MVD基因過量表達(dá)會(huì)顯著增加靈芝中三萜化合物的含量[6].金釵石斛(Dendrobium nobile)為一種名貴藥材，其MVD基因的表達(dá)受到菌根真菌的影響，且莖中MVD基因的表達(dá)量于接菌后期顯著高于對照[7].張曉東等[8]從滇龍膽(Gentiana rigescens)中克隆出MVD基因，并進(jìn)行原核表達(dá)和組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果顯示其主要在根中大量表達(dá).對MVD基因啟動(dòng)子的克隆和分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子序列含有大量光響應(yīng)元件，故推測光照是調(diào)控其表達(dá)的重要因素[9].研究還表明，MVD基因的表達(dá)具有組織特異性[10-11]，并被生物和非生物因素誘導(dǎo)[5，12].

目前，對茉莉花的研究主要集中在茉莉花開放過程中香氣物質(zhì)含量的變化及一些香氣合成相關(guān)酶基因的克隆與表達(dá)分析[13-14]，而對其他組織部位和JsMVD基因的研究尚未見報(bào)道.本試驗(yàn)根據(jù)茉莉花花瓣轉(zhuǎn)錄組中的JsMVD基因序列設(shè)計(jì)上下游特異引物，采用RT-PCR技術(shù)從茉莉花中擴(kuò)增出JsMVD基因，并進(jìn)行序列分析和啟動(dòng)子克隆分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測JsMVD基因在茉莉花植株不同組織及不同激素處理下的表達(dá)量，旨在為進(jìn)一步有效調(diào)控茉莉花香氣中萜類物質(zhì)的合成及茉莉花釋香時(shí)間和強(qiáng)度的調(diào)控提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以雙瓣茉莉花為供試材料.

1.1.2 試劑 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自百泰克生物技術(shù)(北京)有限公司；Easyscript Onestep gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒和Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒購自全式金生物有限公司；Genome Walking kit試劑盒購自TaKaRa公司.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2018年8月選取成熟茉莉花花苞掛牌標(biāo)記，分別用100 mg·L-1IAA、GA和ABA噴灑茉莉花苞，處理時(shí)間分別為0、2、4、6、9和12 h，并以清水(H2O)噴灑茉莉花苞作為對照.摘取上述4種處理茉莉花的根、莖、葉、花蕾及成熟花，采集3次生物學(xué)重復(fù)的樣本，液氮速凍后保存在冰箱(-80℃)中.

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書的方法提取茉莉花植株不同組織的總RNA及不同激素處理下花朵的總RNA，對RNA進(jìn)行濃度和完整性等質(zhì)量檢驗(yàn).參照Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒說明書的方法合成cDNA用于RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測.

1.4 JsMVD基因的克隆

在前期茉莉花轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)序列注釋的信息，從中篩選出相關(guān)的MVD基因編碼的EST序列，將大小超過1 000 bp的片段采用NCBI Blast比對，選擇具有完整開放閱讀框(open read frame，ORF)的MVD基因序列，并根據(jù)此序列在 ORF兩端設(shè)計(jì)全長序列擴(kuò)增引物(上游引物：AAATGGCAGAAGAGAACGGG，下游引物：TCGCCCTCTTCACTTGGGAA)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證全長序列的準(zhǔn)確性.RT-PCR 擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×TransTaq HiFi BufferⅡ、2 μL dNTPs、 0.5 μL 引物、0.2 μL HiFi Polymerase、1 μL 模板，用 ddH2O 補(bǔ)至25 μL.擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min.將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，并參照姚雪倩等[15]的方法進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化并挑取陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司測序.

1.5 JsMVD基因啟動(dòng)子的分離

根據(jù)所得序列，利用Primer Premier 5.0軟件從起始密碼子ATG下游500 bp內(nèi)設(shè)計(jì)3條巢式特異引物[特異引物1(SP1)：AGGCAAAACCAGCAGCAGATGAAG，特異引物2(SP2)：TGACGGCGACAGAAGTGGTAGT，特異引物3(SP3)：TTTTCGTCCCTCTTACCCCAATAC]，引物方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知方向，且SP2的位置應(yīng)設(shè)計(jì)在SP1的內(nèi)側(cè)，SP3位于SP2的內(nèi)側(cè).以提取的茉莉花花瓣的基因組DNA為模板，依據(jù)Genome Walking kit試劑盒說明書程序與試劑盒中的隨機(jī)AP引物進(jìn)行3輪熱不對稱PCR擴(kuò)增.

1.6 JsMVD生物信息學(xué)分析

通過NCBI Blast在線查找所得cDNA全長序列ORF并進(jìn)行同源性分析，用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；用ProtParam、SignalP4.1、WOLF PSOR和Inter ProScan等在線軟件分別對JsMVD保守區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位和結(jié)構(gòu)功能域分析；用SOPME軟件預(yù)測基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過PlantCare網(wǎng)站在線進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測分析.

1.7 JsMVD基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測

以茉莉花植株不同組織和不同激素處理的花朵的cDNA為模板，根據(jù)JsMVD基因全長序列用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物(上游引物：ATAGCAAGGCAAGGTTCAGG，下游引物：GAGGTCATCCCAATGTTTCT)，以茉莉花Actin為內(nèi)參基因，按照Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒說明書的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，試驗(yàn)數(shù)據(jù)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù).數(shù)據(jù)通過Excel軟件用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析，用SPSS軟件在不同顯著水平(P＜0.01，P＜0.05)上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 JsMVD基因的克隆及序列分析

以茉莉花花瓣cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出一條長度約為1 500 bp的單一目的條帶(圖1)，與預(yù)期目標(biāo)相符.測序拼接后顯示MVD基因具有完整的ORF.Blast比對結(jié)果表明，MVD基因序列編碼完整的MVD蛋白，與其他植物MVD氨基酸序列的相似度極高，因此確定MVD基因?yàn)镴sMVD基因.將JsMVD基因序列提交至Gen-Bank，獲得的登錄號(hào)為MH311041.1.

圖1 茉莉花JsMVD基因PCR的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of JsMVD gene

2.2 JsMVD生物信息學(xué)分析

測序所獲得的MVD基因全長序列的長度為1 500 bp，其編碼的JsMVD蛋白含有422個(gè)氨基酸，蛋白分子式為C2057H3271N573O627S19，分子質(zhì)量為46.7 ku，理論等電點(diǎn)為6.57，不穩(wěn)定系數(shù)為39.71，親水性為-0.296，故推測該JsMVD蛋白為親水穩(wěn)定性蛋白.信號(hào)肽經(jīng)SignalP4.1軟件預(yù)測顯示，JsMVD蛋白的N端存在信號(hào)肽的可能性較低，且亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示其位于細(xì)胞質(zhì)中，故推測JsMVD基因在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成后直接催化甲羥戊酸5-焦磷酸(MVAPP)在C5處脫羧，合成萜類化合物共同前體物質(zhì)——異戊烯焦磷酸(IPP).

所得序列經(jīng)Blast比對顯示，JsMVD編碼的氨基酸序列與野生油橄欖(Olea europaeavar.sylvestris，XP＿022889972.1)、牽牛花(Ipomoea nil， XP＿019191905.1)、長春花(Catharanthus roseus， ADR65112.1)和葡萄(Vitis vinifera，XP＿002266399.1)等植物有較高的相似性，相似系數(shù)分別達(dá)到88%、86%、85%和84%.結(jié)構(gòu)域經(jīng)Inter ProScan軟件分析顯示，JsMVD蛋白含有位于第116～174氨基酸處的GHMP激酶N-端保守區(qū)域和第203～420氨基酸處的GHMP激酶C-端保守區(qū)域.JsMVD氨基酸序列含有9個(gè)與ATP結(jié)合有關(guān)的氨基酸及11個(gè)保守的氨基酸[16]，第313位保守的天冬氨酸是決定催化活性大小的關(guān)鍵氨基酸[17].蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)SPOMA軟件分析顯示，JsMVD蛋白主要以α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延長鏈和β-折疊構(gòu)成，分別占37.68%、17.54%、4.74%和4.27%(圖2).

為進(jìn)一步研究JsMVD基因與其他植物同源基因的親緣關(guān)系，分別選取不同植物MVD基因編碼的氨基酸序列，采用鄰近連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.結(jié)果(圖3)顯示：JsMVD基因與野生油橄欖、丹參、假馬齒莧聚為一類，表明這些植物之間的親緣關(guān)系較近；與野生油橄欖的親緣關(guān)系最近，可能由于兩者同為木犀科植物，但僅以43%的自展值連接，這可能與野生油橄欖的發(fā)源地更偏為地中海氣候地區(qū)有關(guān).

2.3 JsMVD基因啟動(dòng)子的分離及其順式作用元件分析

以茉莉花基因組DNA為模板，經(jīng)3輪巢式擴(kuò)增后獲得長度為893 bp的JsMVD基因啟動(dòng)子序列(圖4).經(jīng)PlantCare網(wǎng)站在線分析顯示，JsMVD基因啟動(dòng)子序列包含啟動(dòng)子核心元件TATA-box和啟動(dòng)子增強(qiáng)元件CAAT-box，符合啟動(dòng)子的特征.該區(qū)域含有多種激素響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件GARE和TATC-box，生長素響應(yīng)元件TGA-box；還含有多個(gè)光響應(yīng)元件，如Box I、Sp1、G-box和I-box等；此外，還含有干旱脅迫響應(yīng)元件MBS、胚乳表達(dá)調(diào)控元件Skn-1和生物鐘調(diào)控元件Circadian(表1).

圖2 JsMVD與其他植物MVD的同源比對Fig.2 Homology comparison on JsMVD protein with other plants

圖3 JsMVD與其他植物MVD氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of JsMVD and MVD in other plants

圖4 JsMVD基因上游啟動(dòng)子序列Fig.4 The sequence of upstream promoter element of JsMVD

表1 JsMVD基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件Table 1 List of cis-acting elements in the upstream promoter element of JsMVD

2.4 JsMVD基因mRNA水平的表達(dá)量

2.4.1 不同組織的表達(dá)量 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測茉莉花植株根、莖、葉、花蕾及成熟花等不同組織中JsMVD基因的表達(dá)量.結(jié)果(圖5)顯示，JsMVD基因在各組織中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最低，在成熟花中的表達(dá)量最高，為根中表達(dá)量的20倍左右.

2.4.2 不同激素處理下的表達(dá)量 植物激素是植物體內(nèi)的重要信號(hào)分子，可參與植物次生代謝過程.GA、IAA和ABA噴施茉莉花苞后，JsMVD基因在3種植物激素下均可被誘導(dǎo)表達(dá)，且ABA處理的表達(dá)量上升幅度最大；GA處理2 h后的表達(dá)量最大；IAA和ABA處理4 h后的表達(dá)量最大，隨后呈下降趨勢，但表達(dá)量仍高于對照組(圖6).

圖5 不同組織JsMVD基因的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of JsMVD in different tissues

圖6 GA、IAA和ABA誘導(dǎo)下JsMVD基因的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of JsMVD induced by GA，IAA，and ABA

3 討論

MVD作為甲羥戊酸途徑中的最后一個(gè)催化酶，參與生物體內(nèi)類異戊二烯化合物的合成代謝，其在生物體內(nèi)的表達(dá)水平影響類異戊二烯化合物的生成[17].本試驗(yàn)從茉莉花中克隆得到JsMVD基因，定位于細(xì)胞質(zhì)中，含有GHMP超激酶家族中典型的GHMP超激酶N-端和C-端保守結(jié)構(gòu)域.NCBI同源比對結(jié)果顯示，JsMVD基因編碼的氨基酸序列與其他植物的相似性極高，其中與野生油橄欖的相似性達(dá)到88%，且含有與其他物種共有的保守氨基酸序列，這說明MVD基因在進(jìn)化過程中是相對保守的.MVD蛋白含有一個(gè)保守氨基酸殘基天冬氨酸，為催化活性高低的關(guān)鍵位點(diǎn)，但在不同生物中該活性位點(diǎn)不同，如在表皮葡萄球菌中，其MVD蛋白的保守位點(diǎn)為第283位氨基酸[18]；在滇龍膽中，其MVD蛋白相應(yīng)的保守氨基酸殘基位于第315位；而在JsMVD蛋白中，該氨基酸殘基位于第313位，這說明MVD蛋白具有類似的催化機(jī)制.

本試驗(yàn)首次成功分離了JsMVD基因的啟動(dòng)子序列，該序列包含Box I、Sp1、G-box和I-box等4種光響應(yīng)元件，包含8個(gè)調(diào)控位點(diǎn)，表明光照可能是調(diào)控JsMVD基因表達(dá)的要素之一.李志棟等[9]研究表明，刺五加(Eleutherococcus senticosus)中的MVD基因啟動(dòng)子序列包含2個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件；而Jin et al[19]研究表明，噴施適當(dāng)濃度的Me-JA后，刺五加中的皂苷類化合物明顯升高；Shi et al[6]用不同濃度Me-JA處理靈芝，高濃度(150 μmol·L-1)的Me-JA可促進(jìn)靈芝MVD基因的表達(dá)，而低濃度(100 μmol·L-1)的Me-JA則抑制其表達(dá).在JsMVD基因啟動(dòng)子序列中并未發(fā)現(xiàn)Me-JA響應(yīng)元件，卻含有生長素和赤霉素響應(yīng)元件，這可能是茉莉花與刺五加親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的緣故.在JsMVD基因啟動(dòng)子序列中還含有與生殖有關(guān)的順式作用元件，如胚乳表達(dá)元件Skn-I，在刺五加MVD基因啟動(dòng)子序列中同樣含有[9]，但在靈芝中未發(fā)現(xiàn)[6].

前人在研究茉莉花萜類化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)模式時(shí)多以茉莉花開放時(shí)間為對象[13-14]，而對其表達(dá)空間少有研究.本試驗(yàn)在茉莉花植株的不同組織中均檢測到JsMVD基因的表達(dá)，但表達(dá)量存在顯著差異，在花瓣中大量表達(dá)，這與邢朝斌等[11]的“MVD基因具有組織特異性表達(dá)”的研究結(jié)果相符.Shi et al[6]在靈芝MVD基因上游啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了Me-JA順式作用元件，并用Me-JA處理靈芝，證明了其對靈芝MVD基因的誘導(dǎo)表達(dá).在JsMVD啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)IAA、GA和ABA等植物激素響應(yīng)元件，茉莉花花苞噴施IAA、GA和ABA后，JsMVD基因的表達(dá)量均顯著高于對照組，這說明JsMVD基因的表達(dá)受這3種植物激素的誘導(dǎo).IAA和GA作為促進(jìn)生長的激素，可明顯誘導(dǎo)基因的表達(dá)，但ABA作為一種生長抑制劑，多參與植物逆境脅迫活動(dòng)，卻能誘導(dǎo)茉莉花萜類化合物合成基因的表達(dá)，這可能與萜類化合物具有多種生理作用相關(guān)[20].

本試驗(yàn)首次克隆了JsMVD基因全長cDNA序列，并成功分離出其上游啟動(dòng)子區(qū)域，證實(shí)JsMVD基因在不同器官和不同生長發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，但表達(dá)量存在顯著差異.本試驗(yàn)結(jié)果可為闡明MVD基因表達(dá)對茉莉花萜類化合物合成的影響提供參考.