藤茶總黃酮調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路抗肝纖維化機制的研究*

張文濤，吳先昊，梁冰潔，甘彩玉，鄭作文△

(1.廣西中醫(yī)藥大學藥理教研室，南寧 530200；2.江西省中醫(yī)藥研究院中藥藥理室，南昌 330046)

藤茶總黃酮(tengcha flavonoids，TF)為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡植物中提取的黃酮類成分。藤茶在民間常有應用，是重要的民族用藥。主要用于治療急性結膜炎、感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、肝炎等疾病[1]。本課題組前期藥理研究表明，TF具有明顯地抗肝纖維化的作用[2]，但其機制未明，本研究通過應用TF灌胃來干預小鼠肝纖維化模型，探討TF抗肝纖維化的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 昆明種小鼠98只，雌雄兼用，體質(zhì)量(20±2)g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK桂2014-002。

1.1.2藥物與試劑 TF由廣西中醫(yī)藥大學中藥化學教研室提供；秋水仙堿購自北京索萊寶科技有限公司(批號：505A0316)；金龍魚花生油(批號：20151029)，四氯化碳(CCl4)購自廣東西隴化工廠(批號：20150511)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號：20160725)；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號：20160723)，均購自南京建成生物科技有限公司。Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)試劑盒(批號：201606)，Ⅲ型膠原蛋白(ColⅢ)試劑盒(批號：201606)，轉化生長因子-β1(TGF-β1)試劑盒(批號：201608)，均購自美國R&D公司。兔單克隆抗體α-SMA Lot：GR212262-19，兔多克隆抗體TGF-β1 Lot：GR121841-15，兔單克隆抗體Smad2 Lot：GR269028-1，兔單克隆抗體Smad3 Lot：GR169548-20，兔單克隆抗體Smad4 Lot：GR261313-2，兔單克隆抗體Smad7 Lot：GR241822-21，均購自美國abcan公司。MaxVisonTM試劑盒(批號：160912409C)購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，DAB顯色試劑盒(批號：K165920D)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3實驗儀器 EPOCH型酶標儀購自美國BIO-TEK公司，ST16型離心機購自美國Thermo Fisher公司，BP211D型電子天平購自德國賽多利斯公司，明澈-D24UV型超純水儀購自法國默克密理博公司，Donatello型自動組織處理機購自意大利Diapath.S.p.A公司，Shandon Histocentre 3型組織包埋機購自美國Thermo Fisher公司，RM2235型 組織切片機購自德國Leica公司，YT-7FB型生物組織攤烤片機購自亞光醫(yī)用電子技術有限公司，DM2500型 顯微鏡購自德國Leica公司，KK24T18TI型冰箱購自德國SIEMENS公司。

1.2方法

1.2.1動物分組 取昆明種小鼠98只，根據(jù)性別采用“均衡隨機”方法分為6組，分別為對照組、模型組、秋水仙堿組(0.2 mg/kg)，TF高劑量組(300 mg/kg)、TF中劑量組(150 mg/kg)、TF低劑量組(75 mg/kg)，其中模型組28只小鼠(因前期研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠實驗過程中會出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象)，其余每組14只。除對照組外，其余各組小鼠背部皮下注射25% CCl4花生油溶液，2 mL/kg，每3天1次，連續(xù)10周[3]；對照組背部皮下注射等量100%花生油溶液(每3天1次，連續(xù)10周)。造模同時對照組和模型組小鼠給予蒸餾水灌胃，其余各組給予相應藥物灌胃給藥，給藥體積為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)10周。末次給藥1 h后摘眼球取血，室溫靜置1 h后，2 500 r/min離心10 min取上清液，分裝于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗結束后，各組小鼠處死，迅速取肝組織，生理鹽水洗滌，取部分肝組織剪碎，勻漿，然后轉入EP管中，靜置，離心，取上清液進行分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫砣「闻K左葉浸入4%甲醛溶液中備用。

1.2.2血清生化指標檢測 血清生化指標ALT和AST水平檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3ColⅠ、ColⅢ水平檢測 ELISA法檢測肝組織中ColⅠ，ColⅢ水平，取分裝好的肝組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書測定肝組織中ColⅠ，ColⅢ水平。

1.2.4免疫組織化學法(IHC)檢測 IHC檢測肝組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白的表達情況，石蠟切片常規(guī)脫蠟后，3% H2O2滅活內(nèi)源性酶，室溫孵育20 min，微波進行抗原修復，10 min后5%牛血清封閉，加兔抗鼠一抗，4 ℃孵育過夜。TGF-β1 1∶250稀釋液，Smad2 1∶100稀釋液，Smad4 1∶100稀釋液，Smad7 1∶100稀釋液。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥(二甲苯透明)，中性樹膠封固。IHC切片用Leica DM2500顯微鏡觀察，組織中出現(xiàn)黃褐色為陽性，每張免疫組化切片隨機選取5個視野拍照，用ImageJ2x 進行掃描，以平均光密度和陽性染色面積百分比作為蛋白的相對表達水平。

2 結 果

2.1實驗動物情況 對照組小鼠皮毛光滑油亮，濃密而有光澤，形態(tài)較為豐滿，活動迅速靈敏，眼睛靈動明亮，食欲良好；模型組小鼠毛發(fā)稀疏，毛色暗黃且無光澤，體型消瘦，活動稍顯遲緩，眼睛渾濁，食欲較差。TF低劑量組小鼠被毛稍顯暗淡，體型稍偏瘦，行動較對照組小鼠稍遲鈍，食欲正常，其肝臟為暗淡的紅褐色，被膜欠細膩，質(zhì)地稍硬，偶見邊緣圓鈍。TF高、中劑量組小鼠肉眼觀察毛發(fā)較為濃密，毛色光澤，體型較為豐滿，食欲較好，其肝臟為紅褐色，被膜較光滑細膩，質(zhì)地柔軟，邊緣光整。第9周末隨機取模型組、對照組小鼠各2只，解剖觀察，制作HE染色，觀察發(fā)現(xiàn)對照組小鼠肝細胞細胞質(zhì)飽滿，肝細胞沿肝索整齊排列。模型組的兩只小鼠肝臟呈灰紅色，被膜表面粗糙，質(zhì)地稍硬，邊緣圓鈍，肝組織中纖維化明顯，有假小葉的形成。病理結果表明肝纖維化模型建立成功。第10周末取指標，實驗過程中模型組出現(xiàn)3只小鼠死亡，其中雌性1只，雄性2只。尸檢及肝臟HE染色檢查，死因均為急性肝衰竭，死亡動物不計入統(tǒng)計學處理。對照組最少動物數(shù)為12只，其他各組根據(jù)性別采取“均衡隨機”方法隨機測量12只小鼠肝纖維化相關指標，以便后期更好分析。

表1 各組小鼠血清ALT，AST活性及肝組織中ColⅠ，ColⅢ水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與模型組比較；c:P<0.05，與秋水仙堿組比較

表2 各組小鼠肝臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7、α-SMA蛋白平均光密度比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖1 顯微鏡下各組小鼠TGF-β1蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖2顯微鏡下各組小鼠Smad2蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖3顯微鏡下各組小鼠Smad4蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

2.2各組小鼠肝功能指標及肝組織中ColⅠ、ColⅢ水平比較 模型組、秋水仙堿組、TF高、中、低劑量組小鼠血清ALT、AST均高于對照組(P<0.05)，秋水仙堿組、TF高、中劑量組低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但TF改善肝功能效果并不優(yōu)于秋水仙堿。與模型組比較，TF高、中劑量組及低劑量組ColⅠ，ColⅢ水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖4顯微鏡下各組小鼠Smad7蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖5顯微鏡下各組小鼠α-SMA蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

2.3各組小鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7、α-SMA蛋白表達水平比較 TGF-β1蛋白IHC結果顯示，對照組小鼠TGF-β1在肝臟組織中表達較少，模型組中可見廣泛表達于肝細胞細胞質(zhì)及匯管區(qū)增生的纖維細胞細胞質(zhì)中；秋水仙堿組在肝細胞細胞質(zhì)中仍有較明顯表達，但與模型組相比有明顯地減少；TF高、中、低劑量組TGF-β1在肝細胞細胞質(zhì)中的表達與模型組相比均有所減少，其中TF中劑量組的減少更為明顯(P<0.05)，見圖1。Smad2蛋白IHC結果顯示，對照組小鼠Smad2僅少量表達于細胞核中；模型組可見廣泛表達于細胞核中；秋水仙堿組Smad2在肝細胞核中表達與模型組相比有所減少；TF高、中、低劑量組Smad2在細胞核膜中的表達與模型組相比均有所減少，其中TF高、中劑量組中減少更為明顯，見圖2。Smad4蛋白IHC結果顯示，對照組較少地表達于細胞核核膜；模型組中可見Smad4廣泛地表達于大部分細胞核核膜中；秋水仙堿組在肝細胞核中的表達與模型組相比有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);TF高、中劑量組在肝細胞細胞核及核膜中的表達與模型組相比均有所減少，其中TF高劑量組減少更為明顯(P<0.05)，見圖3。Smad7蛋白IHC結果顯示，對照組小鼠較多地表達于細胞質(zhì)和細胞核核膜；模型組較少地表達于細胞核核膜中，細胞質(zhì)中表達的更少；TF高劑量組與模型組平均光密度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);秋水仙堿組及TF中、低劑量組在肝細胞細胞質(zhì)和細胞核核膜中表達與模型組相比均有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);蛋白陽性表達面積結果顯示，TF高、中、低劑量組與模型組相比表達量均明顯增加，其中TF高劑量組增加的更為明顯，見圖4。α-SMA蛋白IHC結果顯示，對照組僅少量地表達于血管壁；模型組中α-SMA大量表達于肝門靜脈及假小葉的纖維間隔區(qū)域；秋水仙堿組少量地表達于門靜脈及匯管區(qū)；TF高、中、低劑量組與模型組相比蛋白平均光密度均明顯降低(P<0.05)；蛋白陽性表達面積結果顯示，TF高、中、低劑量組與模型組相比均明顯性降低，其中TF高劑量組減少更為明顯(P<0.05)，見圖5。各組小鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7及α-SMA蛋白表達水平比較，見表2、3。

3 討 論

本課題組前期對TF的藥理藥效進行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、保肝降酶、抗病毒、抗腫瘤等作用[2-3]，TF保肝降酶、抗肝纖維化的研究集中在藥理藥效，其作用機制仍不清楚[4-7]。本研究采用CCl4復制小鼠肝纖維化模型，具有成模率高，病變典型等特點。其機制為CCl4經(jīng)肝微粒體的細胞色素P450代謝生成的三氯甲基自由基攻擊細胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過氧化，三氯甲基自由基繼而與細胞膜脂質(zhì)和蛋白大分子進行共價結合，引起膜結構和功能完整性的破壞[8]。ALT、AST存在于機體的臟器和組織中，ALT水平從高到低分布的次序大致為肝、腎、心、肌肉；AST水平從高到低分布的次序大致為心、肝、肌肉、腎。在肝臟ALT主要分布在細胞質(zhì)內(nèi)，AST則分布于細胞質(zhì)和線粒體中。肝組織中的細胞外基質(zhì)(ECM)主要含有ColⅠ、ColⅢ，兩種膠原蛋白的占比變化反映著肝纖維化的病情發(fā)展情況。肝臟在損傷過程的同時，激活了一系列的應激反應，肝纖維化相關的細胞因子的合成和釋放增加，其中TGF-β1是與肝纖維化的形成最為密切的細胞因子之一[9-10]。肝星狀細胞(HSC)的激活是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)，活化的HSC增大、增殖，維生素A水平降低，表型發(fā)生改變并大量表達α-SMA作為骨架蛋白?；罨腍SC由過渡型最終轉化為成纖維類的肌成纖維細胞，使得膠原蛋白的合成增加降解減少[11]。TGF-β1能夠激活HSC，促進肝臟膠原蛋白的合成，抑制ECM的降解，導致肝臟纖維化形成。

TGF-β1是TGF-β超家族中的一員，哺乳動物TGF-β分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3種，其中TGF-β1在肝臟中水平最高且具有生物活性，肝臟損傷時HSC是TGF-β的主要來源。TGF-β受體(TBR)同樣存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類型，其中Ⅰ型和Ⅱ型為絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶，其和TGF-β1的親和力比TGF-β2的親和力強。TβRⅡ在細胞質(zhì)內(nèi)具有Ser/Thr激酶區(qū)，其細胞外端首先與配體結合，細胞內(nèi)段的Ser/Thr激酶被活化，被配基耦合的TβRⅡ使Ⅰ型受體近膜區(qū)GS結構域磷酸化，進而將生物信號向細胞內(nèi)轉導[12-13]。 TβRⅢ無激酶活性，主要作用是調(diào)節(jié)TβRⅡ的膜上表達及配體與受體的親和力，不直接參與TGF-β1/Smad細胞信號通路傳遞。TGF-β1是TGF-β1/Smad信號轉導通路中的啟動因子，TGF-β1連續(xù)激活TβRⅡ、TβRⅠ，TβRⅠ使質(zhì)-核信號分子Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3與Smad4結合，以R-Smad-Smad4三聚體的形式進入核內(nèi)，最終與染色質(zhì)形成核復合物，調(diào)控基因表達。Smad最初在果蠅中發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)稱為Smads蛋白家族。脊椎動物中Smad成員，分為3類，(1)受體激活的Smad(R-Smad)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8亞型。(2)通用型Smad(Co-Smad),目前只有Smad4。(3)抑制型Smad(I-Smad)，包括Smad6、Smad7，其能與受體結合但C端功能區(qū)缺乏磷酸化位點，并且缺少MH1功能區(qū)無法與染色質(zhì)有效結合，是信號轉導中的抑制因子，競爭性抑制R-Smad與TβR結合[14]。TβRⅠ-SA RA-Smad復合體形成后，TβRⅠ激酶將Smad蛋白C端MH2上SSXS基序中色氨酸磷酸化，從而使Smad2/3活化，Smad2/3繼而與TβR及SARA解離，同時與Smad4形成雜聚體，進入細胞核，調(diào)節(jié)轉錄。 TGF-β1/Smad通路通過與C-Jun/C-Fos及P300/CBP等基因轉錄調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用激活膠原酶Ⅰ等膠原相關基因的轉錄[15-16]。STRAP蛋白可與TβRⅠ、Ⅱ連接，又與Smad7特異性聚合并將其運送至活化的TβRⅠ，使TβRⅠ-Smad7復合體形成及穩(wěn)定，從而阻止Smad2、3與受體結合。

本研究結果顯示，與模型組比較，TF通過抑制肝纖維化小鼠肝組織中TGF-β1的過表達，從而抑制HSC的激活，進而阻斷肝纖維化的發(fā)展，使肝組織炎癥、膠原纖維增生情況明顯減輕。IHC結果顯示，其中TF高、中、低劑量均能不同程度下調(diào)肝臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白的表達，并能上調(diào)Smad7蛋白的表達。TF下調(diào)肝臟組織中α-SMA蛋白的表達，抑制ColⅠ，ColⅢ的合成，促進ECM的降解。

綜上所述，TF可能是通過調(diào)控TGF-β1/ Smad信號通路中相關蛋白的表達，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。