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    間充質(zhì)干細(xì)胞通過誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞治療急性肺損傷

    2019-05-30 06:36:24呂海金易小猛易慧敏
    關(guān)鍵詞:流式洗液臍帶

    孫 瑤,呂海金,易小猛,郭 俊,易慧敏

    (中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院外科ICU,廣東 廣州 510630)

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和/或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由多種病因?qū)е碌囊环N危重性呼吸衰竭,是常見的危重癥之一[1-2],缺乏有效的治療手段,病死率高達(dá)30%~40%[3-4]。因此,尋找一種新的有效的治療手段十分有必要。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有自我更新及多向分化能力[5],免疫原性低,有著強(qiáng)大的免疫抑制功能及抗炎能力,被應(yīng)用到各種疾病的治療研究中。目前已經(jīng)有許多研究證明在各種急性肺損傷動物模型中,MSC可以提高存活率,增強(qiáng)細(xì)菌清除能力,能有效減輕肺部炎癥,緩解急性肺損傷[6-7]。但其治療及保護(hù)的具體機(jī)制目前仍不是很清楚。急性肺損傷時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞是呼吸道的重要防線,也是損傷時(shí)的主要效應(yīng)細(xì)胞,巨噬細(xì)胞的極化一般分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用,一般在急性炎癥期占主要部分,可以由脂多糖(LPS)和γ-干擾素(IFN-γ)單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)極化,能產(chǎn)生促炎因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)等。M2型巨噬細(xì)胞具有抑炎作用,可以由白介素4(IL-4)誘導(dǎo)極化,能產(chǎn)生抑炎因子白介素10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β),一般在炎癥消散期占主要部分[8-9]。當(dāng)小鼠巨噬細(xì)胞向M1型極化時(shí),可以使其誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和CD86的表達(dá)上調(diào),向M2型極化時(shí)可以使CD206和Arg1的表達(dá)上調(diào)。從富含M1的巨噬細(xì)胞向富含M2的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移可減輕炎癥過程,促進(jìn)組織修復(fù)和再生??刂品尾康倪^度炎癥反應(yīng),維持促炎反應(yīng)和抑炎反應(yīng)平衡在急性肺損傷的治療中起關(guān)鍵作用[10]。那么在MSC治療過程中對肺泡巨噬細(xì)胞的狀態(tài)是否有影響呢,是否可以通過調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞的極化發(fā)揮治療效果呢。本研究探究MSC在治療急性肺損傷時(shí)對肺泡巨噬細(xì)胞的影響,為治療方向提供新的靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6~8周齡,SPF級balb/c雄性小鼠,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號:SCXK(粵)2013-0002。實(shí)驗(yàn)動物的管理及處置遵循廣東省動物管理委員會準(zhǔn)則及動物福利準(zhǔn)則。

    1.1.2 儀器 多維高清流式細(xì)胞分析儀(BD,LSRFortessa);熒光定量PCR儀(羅氏 LightCycler96);Transwell小室(Millipore,0.4 μm);顯微手術(shù)器械(廣州醫(yī)藥公司醫(yī)療器械批發(fā)中心);動靜脈穿刺針(德國貝朗,18~20 g)。

    1.1.3 試劑 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(Sigma,L4524);anti-mouse流式抗體 F4/80 APC(BioLegend,123116)、CD86 PE(BioLegend,105007)、CD206 FITC(BioLegend,141704)、INOS(BioLegend);anti-human 流式抗體 CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD166、CD44(BD);qPCR 引物(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司);吲哚美辛[前列腺素E2(PGE2)抑制劑]、LY2157299[轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)抑制劑]、NLG-8189[2,3雙加氧酶(IDO)抑制劑)(Sigma);mouse ELISA KIT,TNF-α(eBioscience/BMS607)。

    1.2 人臍帶MSC的分離、培養(yǎng)及鑒定

    1.2.1 人臍帶MSC的分離、培養(yǎng) 在產(chǎn)婦及其家屬知情同意下及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)下,無菌條件下獲取健康足月剖宮產(chǎn)臍帶5~8 cm。沖洗干凈,剔除臍靜脈及臍動脈后,剪碎成約1 mm3的小塊。取適量組織小塊到10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,加入10 mL MSC完全培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待有細(xì)胞爬出貼壁時(shí),更換培養(yǎng)基,1周后取出組織塊,繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞融合到80%~90%,按1∶3比例進(jìn)行傳代接種。第3~6代用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 臍帶MSC的鑒定 ①表型鑒定:第4代MSC,吸去培養(yǎng)基,PBS洗兩遍,用2.5 g/L胰酶消化下來,300×g離心5 min,棄上清,用PBS重懸并計(jì)數(shù)。每管細(xì)胞約106個(gè),用100 μL PBS重懸,分別標(biāo)記 anti-human CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD166、CD44等抗體,渦旋,4 ℃孵育30 min,后每管加2 mL PBS洗兩遍,洗去未結(jié)合的抗體,最后用250 μL PBS重懸,渦旋后上機(jī)進(jìn)行流式檢測。②成骨誘導(dǎo)分化:將第4代臍帶MSC接種于6孔板中,待細(xì)胞融合達(dá)到90%,吸掉舊培養(yǎng),加入成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基,每3 d換液,誘導(dǎo)14 d后用茜紅素染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。③成脂誘導(dǎo)分化:同上,加入成脂誘導(dǎo)A液,誘導(dǎo)3 d后換液加入成脂誘導(dǎo)B液誘導(dǎo)1 d,反復(fù)7個(gè)循環(huán)后,進(jìn)行油紅染紅觀察脂滴形成情況。

    1.3 建立小鼠急性肺損傷(ALI)模型

    參考 Danchuk[11]和 Mei[12]的方法,采用 LPS 滴鼻法進(jìn)行ALI造模。具體為:采用氯胺酮/甲苯噻嗪(Ketamin/Xylazine)混合麻醉劑90/7.5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠,將麻醉好的小鼠以上面兩顆門牙為勾懸掛于4號線上,將小鼠舌頭輕輕向一側(cè)拉出,保持氣道開放。根據(jù)體質(zhì)量滴入相應(yīng)的LPS(5 mg/kg)或等量的PBS。滴完后靜止3~5 min,觀察呼吸無異常后,將小鼠置于雙手掌心,左右翻轉(zhuǎn)使滴入液體在小鼠肺內(nèi)分布均勻。

    1.4 肺組織病理評分

    取完整肺組織用40 g/L多聚甲醛固定,固定后取左肺葉行病理切片和蘇木素-伊紅(hematoxylineosin staining,HE)染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理改變,并進(jìn)行肺損傷評分[13]。在光學(xué)顯微鏡下,每張片隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野,對以下4個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行評分:①肺泡充血,②出血,③肺泡和肺間質(zhì)炎癥(肺間隙中性粒細(xì)胞集聚或浸潤),④肺水腫程度(肺泡壁增厚或透明膜形成)。評分標(biāo)準(zhǔn)0分:最輕微損害,1分:輕度損害,2分:中度損害,3分:重度損害,4分:最嚴(yán)重?fù)p害,總分相加即為病理評分。

    1.5 肺泡灌洗液的獲取

    經(jīng)尾靜脈注射MSC及PBS后48 h,采用10%水合氯醛深度麻醉小鼠,取仰臥位并固定四肢,使用動靜脈置管進(jìn)行氣管穿刺,用1 mL注射器連接動靜脈置管口,每次1 mL PBS,反復(fù)灌洗3次,回收的液體即為肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。300×g,5 min離心后上清凍于-80 ℃度冰箱進(jìn)行ELISA檢測,離心得到的細(xì)胞,若紅細(xì)胞較多可裂紅,裂紅后用PBS重懸計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完后,剩下的細(xì)胞離心,用于流式檢測及提取RNA。

    1.6 肺泡灌洗液細(xì)胞和MH-S細(xì)胞流式檢測

    分別從體內(nèi)及體外獲得肺泡灌洗液細(xì)胞和MH-S細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,細(xì)胞總數(shù)在(0.5~1)×106個(gè)細(xì)胞之間。將細(xì)胞重懸在100 μL PBS中,分別標(biāo)記 anti-mouse F4/80 APC、CD86 PE、CD206 FITC流式抗體,方法同上MSC流式檢測。

    1.7 熒光定量PCR(qPCR)檢測巨噬細(xì)胞CD86、TNF-α、CD206、IL-10、Arg-1的mRNA表達(dá)水平

    根據(jù)Trizol使用說明書提取細(xì)胞總RNA,測濃度,取1 μg RNA用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行熒光定量PCR時(shí),以GAPDH作為內(nèi)參。采用SYBR Green Master(Rox)(Roche)在羅氏 LightCycler96儀器上完成操作。實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列如表1所示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    表1 用于定量RT-PCR的基因名稱和引物序列Table 1 Gene names and primer sequence used for quantitative RT-PCR

    1.8 ELISA檢測

    小鼠肺泡灌洗液300×g,5 min離心后得到上清,根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作,檢測小鼠TNF-α因子的濃度,每組重復(fù)3次。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 20軟件分析數(shù)據(jù),呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)采用ANOVA分析或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),以Bonferroni法檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)間多重比較;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,當(dāng)P<0.05時(shí),認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    圖1 臍帶MSC的形態(tài)、成骨和成脂分化能力鑒定及表面標(biāo)記鑒定Fig.1 Identification of morphological,osteogenic and adipogenic differentiation capacity and surface markers of umbilical cord MSC

    2 結(jié)果

    2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、成骨成脂分化能力鑒定及表型鑒定

    MSC細(xì)胞呈貼壁生長,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈長梭形,平行排列或旋渦狀(圖1A)。第4代MSC成骨誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行茜素紅染色,可見細(xì)胞爬片上出現(xiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)(圖1B);成脂誘導(dǎo)28 d后行油紅染紅可見紅色的脂滴(圖1C)。用第4代的MSC進(jìn)行表面markers標(biāo)記,流式結(jié)果顯示為CD29、CD90、CD73、CD105、CD166、CD44呈強(qiáng)陽性表達(dá),CD45、CD34呈陰性表達(dá)(圖1D)。

    2.2 MSC在體外誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系(MH-S細(xì)胞)向M2型極化,該作用可以被PGE2抑制劑能逆轉(zhuǎn)

    將巨噬細(xì)胞和MSC共培養(yǎng)后,檢測M2型巨噬細(xì)胞marker CD206、IL-10、Arg1。發(fā)現(xiàn)MSC可以誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞向M2型極化,LPS+MSC組(n=3)CD206陽性細(xì)胞的比例較LPS組(n=3)明顯升高(圖2A;19.7%±0.6%vs 11.4%±0.7%,t=8.936,P <0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。在mRNA水平上,LPS+MSC組IL-10和Arg1水平也較LPS組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2,圖2C、D)。我們在MSC和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入了MSC可溶性因子的抑制劑,發(fā)現(xiàn)加入PGE2 inhibitor(n=3)時(shí)CD206陽性細(xì)胞比例明顯低于LPS+MSC組(n=3;8.4%±0.9%vs 18.5%±1.4%,t=6.137,P<0.01)。加入TGF-β抑制劑、IDO抑制劑,CD206陽性細(xì)胞比例差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2E)。

    圖2 MSC在體外誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞向M2型極化,前列腺素E 2抑制劑能逆轉(zhuǎn)該作用Fig.2 MSC induce MH-S cells to polarize to M2 phenotype in vitroand prostaglandin E2 inhibitor can reverse the effect

    2.3 MSC有效改善小鼠ALI模型

    接下來,我們利用LPS成功誘導(dǎo)了急性肺損傷模型;光鏡下觀察可見control組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常,病理評分低;ALI組有較多肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡破裂、融合,肺泡有較明顯的充血及出血,間質(zhì)增寬,肺泡腔及間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤,肺組織病理評分高;ALI+MSC組肺損傷程度明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(圖3A)。ALI組病理評分較高,ALI+MSC組(n=5)病理評分較ALI組(n=5)明顯降低(4.2±0.4 vs 13.4±0.5,t=14.55,P < 0.001;圖3B)。

    表2MH-S細(xì)胞的IL-10和Arg1 mRNA相對表達(dá)水平Table 2 Relative expression levels of IL-10 and Arg1 mRNA in MH-S cells

    2.4 MSC治療急性肺損傷模型伴隨巨噬細(xì)胞向M2型極化

    進(jìn)一步為了研究MSC在體內(nèi)對肺泡巨噬細(xì)胞的影響,通過對肺泡灌洗液流式檢測發(fā)現(xiàn),ALI+MSC組(n=3)CD206陽性細(xì)胞比例明顯高于ALI組(n=3;37.6%±1.4%vs 8.5%±0.4%,t=20.09,P<0.001;圖4A、B),ALI+MSC組(n=3)中INOS陽性細(xì)胞比例較ALI組(n=3)明顯降低(5.90%±0.16%vs 40.27%±5.87%,t′=5.86,P=0.028;圖4C、D)。肺泡灌洗液細(xì)胞中的TNF-α和CD86的mRNA表達(dá)水平較ALI組明顯降低,CD206和IL-10的mRNA表達(dá)水平ALI+MSC組較ALI組明顯升高(表3,圖4E)。ELISA結(jié)果顯示ALI組(n=3)TNF-α明顯升高,ALI+MSC組(n=3)TNF-α濃度明顯降低(412.3±6.5 vs 527.4±5.6,t=13.4,P <0.001;圖4F)。

    圖3 MSC對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷病理學(xué)改變的影響Fig.3 The effects of MSC on histopathological changes in LPS-induced ALI in mouse

    3 討論

    急性肺損傷發(fā)病誘因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制不明確,缺乏有效的治療手段。在急性肺損傷病程中,肺泡巨噬細(xì)胞可以抵御呼吸道病原體,并在遠(yuǎn)端支氣管及肺泡中參與炎癥反應(yīng)[14],是主要的效應(yīng)細(xì)胞[15]。但因其根據(jù)所處微環(huán)境的改變具有向不同表型極化的特性,使其在急性肺損傷病程中成為一把雙刃劍[16]。

    表3BALF中細(xì)胞CD86、TNF-α、CD206和IL-10 mRNA相對表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of CD86,TNF-α,CD206 and IL-10 mRNA in BALF cells

    表3BALF中細(xì)胞CD86、TNF-α、CD206和IL-10 mRNA相對表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of CD86,TNF-α,CD206 and IL-10 mRNA in BALF cells

    ALI:acute lung injury;MSC:mesenchymal stem cell.

    ?

    已有研究證實(shí),輸注MSC治療后可以減少促炎因子的產(chǎn)生,并能與巨噬細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10[16]。并且MSC可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及殺菌功能[14],但是MSC與巨噬細(xì)胞之間的相互作用目前并不明確。我們用MSC在體外和小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系(MH-S細(xì)胞)隔離共培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)MSC可以誘導(dǎo)CD206陽性的細(xì)胞增多,并且IL-10的表達(dá)水平也比LPS刺激組明顯增加。說明MSC發(fā)揮作用并不通過與巨噬細(xì)胞直接接觸,而是通過旁分泌途徑。許多研究已經(jīng)證明MSC可以分泌多種可溶性因子,PGE2是其中的一種強(qiáng)效的免疫調(diào)節(jié)作用的因子。有文獻(xiàn)報(bào)道,創(chuàng)傷時(shí),PGE2能促進(jìn)傷口處的巨噬細(xì)胞向M2極化從而促進(jìn)傷口的修復(fù)[17],也有研究指出在小鼠過敏氣道炎癥模型中,當(dāng)血液中PGE2濃度升高時(shí),肺中的巨噬細(xì)胞向M2極化增多,并且這種增多可以被PGE2的抑制劑阻止。我們在MH-S和MSC共培養(yǎng)培養(yǎng)體系中加入PGE2、TGF-β、IDO的抑制劑,發(fā)現(xiàn)只有PGE2抑制劑可以明顯逆轉(zhuǎn)MSC對M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)。有研究證明PGE2部分通過激活cAMP途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞向M2極化,但潛在的機(jī)制尚不清,是否還通過其他途徑來誘導(dǎo)M2極化,仍需我們進(jìn)一步深入研究。

    在本研究中,我們成功建立了小鼠急性肺損傷模型,輸注臍帶MSC后的確能緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷癥狀。MSC治療組肺泡巨噬細(xì)胞CD206陽性的細(xì)胞比例明顯升高,并且IL-10和Arg1的表達(dá)也是明顯升高的。我們從體內(nèi)體外均證明MSC能抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)抑炎因子的產(chǎn)生,在體外可以通過旁分泌途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。并且MSC發(fā)揮這種治療作用是通過PGE2途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化途徑,但巨噬細(xì)胞發(fā)生這種表型改變的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。由此可以為MSC用于臨床治療ALI提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

    圖4 MSC能誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中的M2型巨噬細(xì)胞增多Fig.4 MSC can induce M2 macrophage increase in bronchoalveolar lavage fluid of mice with ALI

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