藍引樂,朱 妤,王建華,凌元亮
(浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院1.呼吸科,2.中醫(yī)科,浙江杭州310012;3.杭州市拱墅區(qū)祥符社區(qū)衛(wèi)生服務中心,浙江杭州310023)
哮喘是兒童高發(fā)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,其主要特征是氣道重塑、炎癥和支氣管高反應性[1]。氣道重塑是哮喘發(fā)生的重要環(huán)節(jié),與疾病嚴重程度與預后密切相關[2]。支氣管平滑肌細胞(bronchial smooth muscle cells,BSMC)的異常增殖在氣道重塑中具有重要作用[3],由于其支氣管平滑肌細胞增殖與遷移增強,其病理特征表現(xiàn)為支氣管平滑肌腫塊增加。哮喘是由多種細胞參與的慢性氣道炎癥[4],支氣管平滑肌細胞的異常增殖已成為哮喘防治中人們關注的焦點,減少過度增殖的氣道平滑肌組織的可以通過改善哮喘的癥狀,支氣管平滑肌細胞的異常增殖與遷移被認為是抗哮喘治療的主要靶點[5]。現(xiàn)有的研究已經證實,促激活和促纖維化的細胞因子與支氣管平滑肌細胞密切相關[6]。細胞因子主要包括白細胞介素(interleukin,IL)家族、轉化生長因子beta(TGF-β)等[6]。白細胞介素家族是哮喘中支氣管平滑肌細胞的結構和功能異常的主要參與者之一。細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)是T 細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因子,研究發(fā)現(xiàn)IL-17在哮喘患者血液中表達顯著增高[7-8],但是IL-17對支氣管平滑肌細胞的效應尚不清楚。JAK/STAT通路可被促炎細胞因子激活,導致STAT轉錄因子磷酸化[9],且在哮喘患者顯示支氣管組織內JAK/STAT通路被激活[10]。對此本研究對IL-17對BSMC的增殖刺激作用進行探索,驗證是否JAK/STAT3信號通路參與其中。
人BSMC來源于自上海斯信生物科技有限公司。采用含有100 mL/L胎牛血清(ThermoFisher Science公司,美國)、0.5 g/L表皮生長因子和2 g/L成纖維細胞生長因子的M199培養(yǎng)基在37℃體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。細胞生長達到70%~80%匯合時,使用10 mL/L ITS預混物(BD Bio公司,美國)增強的F12/DMEM(50∶50混合比例)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。然后用不同濃度(0.1、1、10 ng/mL)的IL-17(Sigma Aldrich公司,美國)分別處理細胞不同時間(24、48、72 h)。為研究IL-17對JAK-STAT3信號通路的影響,采用JAK-STAT3信號通路的特異性抑制劑50 μmol/L AG490(Selleck公司,美國)預處理細胞30 min,然后與10 ng/mL IL-17共同孵育48 h。
使用MTT法檢測IL-17對人支氣管平滑肌細胞活力的影響。細胞密度以5×103個/孔接種于96孔板中,貼壁12 h后,無血清培養(yǎng)基同步化12 h,再使用(0、0.1、1、10 ng/mL)IL-17分別刺激細胞不同時間(24、48、72 h)后,加入20 mg/L的MTT試劑,培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng)后吸去孔內培養(yǎng)液。每孔加入150 μL的二甲基亞砜,震蕩溶解晶體,用分光光度法測定在570 nm處的吸光度,實驗測試重復3次。
使用BrdU標記方法測定BSMC增殖。5×103個/孔BSMC接種于96孔板中,貼壁12 h后,無血清培養(yǎng)基同步化12 h,按照實驗要求,進行細胞處理。處理的細胞按照按照BrdU試劑盒(艾美捷公司,中國武漢)操作說明書,孵育10 μmol/L BrdU試劑24 h,然后用PBS洗滌細胞,用40 g/L的多聚甲醛包封10 min,隨后用0.3%Triton X-100孵育20 min,使細胞膜通透。使用含5%BSA、0.1%Triton X-100的0.1 mol/L PBS封閉1 h。加入BrdU一抗封閉過夜。次日使用PBS洗滌后加入二抗孵育30 min。洗凈后使用DAPI(碧云天公司,中國海門)染色5 min,封片劑封片。使用熒光顯微鏡觀察BrdU陽性細胞。實驗測試重復3次。
5×106個/孔BSMC接種于6孔板中,貼壁12 h后,無血清培養(yǎng)基同步化12 h,按照實驗要求進行處理細胞。達到實驗要求的時間終點時,用不含EDTA的2 g/L胰酶消化,1 000×g離心5 min收集細胞。-20℃在70%乙醇中固定一夜,4℃下1 000×g離心5 min。PBS洗滌后4℃下1 000×g離心5 min。隨后將細胞重懸在300 μL碘化丙啶染色緩沖液(碧云天公司,中國海門)中,在室溫下孵育30 min。使用流式細胞儀(BD Bio公司,美國)進行DNA含量分析。實驗測試重復3次。
使用24孔遷移室板(Chemicon公司,美國)來檢測細胞遷移。收集按照實驗要求處理后的BSMC,用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度為5×106個/mL,取100 μL細胞懸液接種到上腔室中,下腔室加入600 μL含10%FBS培養(yǎng)基。在37℃在體積分數(shù)5%CO2條件下孵育24 h后,取小室并擦除上室上膜細胞。在室溫下用龍膽紫(Sigma-Aldrich公司,美國)染色10 min,隨后用水沖洗10 min,室溫下空氣干燥20 min,在光學顯微鏡明場下計數(shù)5個隨機視野(200×,Nikon公司,日本)膜表面的細胞數(shù)量進行計數(shù),每個試驗組重復3次。
收集按照實驗要求處理后的BSMC,用預冷的PBS洗滌細胞3次,然后用250 μL的RIPA緩沖液和2.5 μL PMSF在冰上孵育30 min。收集細胞后,在13 000×g下離心10 min,在4℃下測定細胞裂解物的蛋白濃度。將蛋白裂解物(每樣品50 μg)和緩沖液按比例混合,然后在100°C煮沸5 min。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜至PVDF膜。PVDF膜在室溫下在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h。然后在4℃下與一抗體孵育過夜,稀釋后的抗體包括單克隆小鼠抗人GAPDH(1∶5 000)和山羊抗人p-STAT3(1∶1 000)(Santa Cruz公司,美國),單克隆小鼠抗人JAK(1∶1 000),單克隆小鼠抗人STAT3(1∶1 000)(Santa Cruz公司,美國)。用TBST進行洗滌后,將膜與二抗孵育。使用化學發(fā)光免疫印跡免疫檢測試劑盒(Invitrogen公司,美國)曝光顯影。然后,使用IPP軟件掃描蛋白灰度值,然后以GAPDH灰度值為內部參照,對膠片進行半定量分析。實驗測試重復3次。
使用Graphpad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。經檢測各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示為。對于不同時間點和不同濃度的IL-17對細胞活性的影響,采用有交互作用的兩因素方差分析,檢驗水平α=0.05。兩組數(shù)據(jù)的比較采用成組t檢驗。其余多組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用單因素方差分析后Bonferoni檢驗。P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。
為確定IL-17對BSMC增殖作用的影響,本研究首先使用濃度梯度為0、0.1、1和10 ng/mL的IL-17分別處理BSMC 24、48、72 h,隨后使用MTT檢測。如圖1A顯示,時間效應對BSMC增殖的影響差異有統(tǒng)計學意義(Ftime=23.352>F(2,24)=3.400,P=0.011);濃度效應對BSMC增殖的影響差異有統(tǒng)計學意義(Fconcentration=33.412> F(3,24)=3.010,P=0.009);時間與濃度交互作用對BSMC增殖的影響差異有統(tǒng)計學意義(Finteraction=11.635>F(6,24)=2.510,P=0.018);其中1 ng/mL IL-17作用BSMC 72 h和10 ng/mL IL-17作用BSMC 24、48、72 h均能升高細胞活力(P均<0.05);其中10 ng/mL IL-17作用BSMC 48、72 h細胞活力最高,而10 ng/mL IL-17作用48 h與作用72 h相比,無統(tǒng)計學差異。基于MTT實驗結果,后面的實驗條件采用10 ng/mL IL-17處理48 h。隨后本研究對細胞進行了BrdU染色和細胞周期進行了檢測。BrdU染色的結果顯示,10 ng/mL IL-17處理后,BrdU陽性細胞數(shù)顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(t=24.438,P < 0.001;圖1B)。細胞周期結果顯示,10 ng/mL組G1期BSMC百分比明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(t=29.146,P <0.001);而S期(t=19.741,P <0.001)與G2/M期(t=38.352,P<0.001)均高于對照組(圖1C、D)。這些結果提示IL-17能夠促進細胞增殖和細胞周期運行。隨后我們對細胞的遷移進行評估,結果顯示10 ng/mL組BSMC的遷移顯著上調,差異具有統(tǒng)計學意義(t=26.254,P < 0.001;圖1E、F)。這些結果表明,IL-17可促進支氣管平滑肌細胞的增殖和遷移。
圖1 IL-17促進對支氣平滑肌細胞增殖與遷移Fig.1 IL-17 promotes the proliferation and migration in BSMC
為了探索IL-17對BSMC增殖作用的機制,本研究對BSMC的JAK/STAT3信號通路進行了檢測。Western bolt實驗檢測發(fā)現(xiàn)IL-17處理BSMC后p-JAK(t=5.235,P=0.012)、p-STAT3(t=9.438,P=0.003)均表達上調(圖2),差異有統(tǒng)計學意義;而 JAK(t=0.665,P=0.643)和 STAT3(t=0.431,P=0.725)變化差異無統(tǒng)計學意義。提示IL-17促進支氣管平滑肌細胞的增殖和遷移可能是通過促進激活JAK/STAT3信號通路。
為探索AG490是否對IL-17引起支氣管平滑肌細胞JAK/STAT3信號通路的增強起到了抑制作用,本研究對AG490處理BSMC后JAK/STAT3信號通路進行了檢測。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)AG490有效抑制了JAK/STAT3信號通路,p-JAK(P=0.015)、p-STAT3(P=0.026)表達下調(圖3),差異有統(tǒng)計學意義。結果提示,AG490對IL-17引起支氣管平滑肌細胞JAK/STAT3信號通路的增強起到抑制作用。
圖2 IL-17激活支氣管平滑肌細胞JAK/STAT3信號通路Fig2 IL-17 activates the JAK/STAT3 signaling pathway in BSMC
圖3 AG490抑制IL-17激活的支氣管平滑肌細胞JAK/STAT3信號通路Fig.3 AG490 inhibits the activation of JAK/STAT3 signaling pathway induced by IL-17 in BSMC
為證明JAK/STAT3信號通路參與了IL-17誘導的支氣平滑肌細胞的增殖激活與遷移,本研究使用AG490來特異性阻斷JAK/STAT3信號通路,進一步觀察細胞活性、細胞增殖、細胞周期與細胞周期的變化。MTT檢測結果顯示AG490可阻止IL-17引起的BSMC的細胞活力增加(圖4A),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.022);BrdU染色結果顯示AG490降低了IL-17處理引起的BrdU陽性細胞數(shù)增多的現(xiàn)象(圖4B、C),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.017);細胞周期(圖4D和4E)結果顯示,AG490+IL-17處理組G1期BSMC百分比明顯高于IL-17單純處理組(P <0.001);而S期(P=0.003)與G2/M期(P<0.001)均低于IL-17單純處理組,差異具有統(tǒng)計學意義。提示用AG490處理能夠減少IL-17導致的支氣管平滑肌細胞增殖。隨后本研究對細胞的遷移進行評估,結果顯示AG490抑制了IL-17處理引起的BSMC的遷移上調(圖4F、G),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。這些結果表明,抑制JAK/STAT3信號通路緩解了IL-17誘導的支氣管平滑肌細胞的增殖與遷移作用。
氣道重塑是哮喘患者的突出病理特征[2],局部氣道炎性細胞持續(xù)浸潤可刺激支氣管平滑肌增生,誘發(fā)氣道重塑的發(fā)生[11],氣道重塑的程度與病情及預后直接有關[2]。對人和哮喘小鼠模型支氣管平滑肌細胞增殖活性和遷移變化的分析表明,患病組氣道平滑肌細胞增殖活性和遷移均明顯高于對照組[12-13]。提示哮喘過程中氣道平滑肌細胞增殖過度和發(fā)生遷移運動,因此,抑制支氣管平滑肌細胞增殖和遷移是治療支氣管哮喘的重要策略。哮喘的發(fā)病過程中免疫系統(tǒng)的功能異常參與其中。與免疫反應相關的炎癥細胞因子可促進支氣管免疫反應的發(fā)生。以前的研究中發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘大鼠模型中的細胞因子顯著增高的現(xiàn)象,這些細胞因子誘導肥大細胞與支氣管平滑肌細胞結合,促進肥大細胞的存活和增殖,促進炎性物質的積累,使支氣管平滑肌細胞增殖與遷移,支氣管平滑肌的增殖與遷移增強可導致氣道高反應性[14]。但這些細胞因子對支氣管平滑肌細胞的刺激作用的機制和作用并未明確。
圖4 AG490抑制IL-17誘導的支氣平滑肌細胞的增殖與遷移Fig.4 AG490 inhibits the proliferation and migration in BSMC induced by IL-17
IL-17由CD4+T細胞分泌,能夠誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞合成分泌其他細胞因子,參與調節(jié)細胞增殖和分化[15]。哮喘患者氣道中IL-17表達上調,炎癥因子刺激后IL-17的表達水平在在氣道平滑肌中增加[16]。這些研究表明,IL-17水平升高可能與BSMC增殖有關。IL-17通過與IL17RA形成的受體復合物觸發(fā)信號[17],IL17RA在BSMC上表達分布[18],表明IL-17能夠直接作用于氣道平滑肌細胞。哮喘患者體內IL-17的增加可能直接作用于氣道平滑肌細胞以誘導其增殖增生。在這里,我們證明了IL-17對支氣管平滑肌細胞增殖和遷移的促進作用,這與之前在哮喘小鼠模型中,用抗IL-17A抗體中和IL-17A可減少炎性細胞氣道浸潤的結果吻合[19]。使用人抗IL17RA單克隆抗體,阻斷IL-17的生物活性,可控制患者中度至重度哮喘[20],這些藥物的潛在機制可能與對BSMC增殖和遷移的抑制作用相關。
STAT3是一種轉錄因子,在哮喘中具有高活性[21]。IL-17表達與STAT3磷酸化顯著相關,STAT3可由IL-17激活促進細胞的生長和炎癥等反應[22]。STAT3在細胞的生存、增殖和遷移中起著重要作用,因此被認為是抗細胞增殖相關的治療靶點。STAT3活性增強可以促進氣道平滑肌細胞的細胞增殖[23]。而JAK/STAT抑制劑可以用于包含哮喘在內的過敏性疾病的治療[24]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),IL-17能促進STAT3的磷酸化,促進STAT3的活化從而誘導支氣管平滑肌細胞增殖。JAK/STAT3通路阻斷劑阻斷IL-17誘導的支氣管平滑肌細胞增殖活化過程。這些結果說明IL-17通過促進支氣管平滑肌細胞中JAK/STAT3通路的表達而激活增殖遷移過程。
本研究利用細胞培養(yǎng)技術探索了支氣管平滑肌細胞增殖與遷移的分子機理,探尋調控支氣管平滑肌細胞細胞生長的關鍵細胞周期事件,從而為治療哮喘提供了理論依據(jù)和新靶點。本研究表明IL-17調節(jié)支氣管平滑肌細胞的增殖和遷移過程,且這一過程由JAK/STAT3信號轉導通路介導,該機制可能參與了哮喘患者的氣管重塑,哮喘患者有望應用針對JAK/STAT3信號轉導通路的藥物緩解氣管重塑。