Lnc-1708對體外人骨髓間充質干細胞成骨分化的抑制效應

曹峻川，孫 翔，趙建江

（南方醫(yī)科大學1.口腔醫(yī)學院，2.口腔醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 廣州 510260）

頜面部發(fā)生的外傷、腫瘤、先天畸形和牙缺失后導致的牙槽骨吸收等常引發(fā)患者頜面部骨組織缺損，造成顏面畸形，引起語言、咀嚼、呼吸等機能障礙，在患者的生理和心理上造成不良的影響。常規(guī)的自體及異體骨移植在兼具形態(tài)和功能的修復缺陷上，存在著各自的利弊和局限性。而骨組織工程的興起為骨缺損修復開辟了新的方法［1］。骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC）是骨組織工程的重要種子細胞，有穩(wěn)定的自我更新和增殖的能力，同時具有多種分化潛能，能夠誘導分為成骨、成軟骨、脂肪細胞等細胞譜系［2-3］。因此研究hBMSC成骨分化作用的機制，對探索頜面部骨缺損修復方法有著十分重要的意義。Long non-coding RNA（lncRNA）是目前被認知較多的一種非編碼RNA，目前人類基因組計劃（版本20，GRCH38）已經識別了24 489個lncRNA以及14 470個lncRNA基因轉錄本［4］。雖然越來越多的研究證實lncRNA參與了干細胞增殖分化的調控，但目前僅有少數已知的lncRNA，如lncRNA-NONHSAT009968，lncRNA-H19，lncRNA HoxA-AS3等［5-7］，被證實有調控hBMSC成骨分化的作用。本課題組前期通過高通量測序技術發(fā)現了未知lncRNA-1708，并發(fā)現其在hBMSC成骨分化前后具有表達差異性。因此，本研究用PCR檢測lncRNA-1708在hBMSC成骨誘導分化前后的表達量，探討其與hBMSC成骨分化的關系，同時通過構建慢病毒載體及干擾質粒調控lncRNA-1708在hBMSC中的表達，探討lncRNA-1708對hBMSC成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

原代人骨髓間充質干細胞（sciencell-7500，美國），成骨分化培養(yǎng)基（sciencell-7531，美國）；lncRNA-1708過表達慢病毒，慢病毒空載體陰性對照（空載體，pBABE pure），lncRNA-1708干擾質粒（sh-lncRNA-1708），lncRNA-1708干擾質粒的陰性對照［sh-lncRNA-1708 negative control（PLKO.1）］（蘇州金唯智生物科技，中國）；293FT細胞（invitrogen，美國）；cDNA反轉錄試劑盒-RR047A（TAKARA-RR047A，日本）；熒光定量PCR試劑盒（TAKARA-FP215，日本）；堿性磷酸酶染色試劑盒（sigma-85L1-1KT，美國）。

1.2 細胞的復蘇及傳代培養(yǎng)

將凍存的原代hBMSC迅速放入37℃水浴中至完全融化，按5×103/cm2接種密度將原代hBMSC接種于多聚賴氨酸包被的T-75培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分數為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)基以去除殘留的DMSO和未貼壁細胞。此后每3 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞達到90%融合時應用適量0.25%胰酶/0.02%EDTA消化，按1∶3傳代擴增，進傳代培養(yǎng)至P3代。

1.3 熒光定量PCR（RT-PCR）驗證lncRNA-1708的表達情況

根據本實驗前期的測序實驗結果，取3組來源于不同個體hBMSC（貨號均為sciencell-7500），按成骨分化前后分別設置實驗組與對照組（P1-N1，P2-N2，P3-N3）。具體步驟：按每孔2×104/cm2個細胞的密度將P3代的hBMSC接種于6孔板上，待細胞生長融合超過70%時，更換為間充質干細胞成骨分化培養(yǎng)基，每3 d用新鮮成骨分化培養(yǎng)基完全替換培養(yǎng)基，成骨誘導分化7 d后收集細胞。按照Trizol試劑盒操作說明書步驟提取細胞總RNA。引物序列，forward：5′-CGTCACCTCTACCTCCTTAATAC-3′，reverse：5′-CAGGTTTTACTGCATATGTAGATAGTG-3′。

1.4 慢病毒包裝

lncRNA-1708慢病毒載體和lncRNA-1708沉默質粒（sh-lnc-1708）均購買自蘇州金唯智生物科技。在6孔板中接種120萬細胞/孔（6孔板中），16 h后，將構建好的載體按Lipofectamine 2000（Promega，美國）轉染試劑盒步驟轉進293FT細胞中，8 h換液，48 h后收集上清液，在4°C下保存。pBABE pure載體的酶切位點見圖1。lncRNA-1708測序結果序列（904 bp）：GTTCTAGTACTACTAACACGACTACCAGAAAAATTACCTGGCCACTCTAAG CCTTGGTTTATTGAGCTATAATATTAAAATACTAT CTACACTGCTGTCCTTTACATGGTTGCCAAGAAAAAAGCTGATATATAACTGTGCCATATAAACTCTAAAATTGTACAAATATTCCCATTACTAAAATATGACAAAATAATTTTGTATGGGCTCTGAAAATGATTAACCTACTTTTCCACTGAATTCTAAGACAAAAAATCAAGATTAACACAGTAATTATTGAAAATATGTCCCTTCAATCATTACAAAAACCTGTTGATAAAACCTTCCCAAAAGATTTAATCATACAAGTATCTGACATTACCATCATTATTGAGTAGTCACCATAATCCAGACACTGCTAAAACATTTTCTAATTTAATCTTCACATTAACTATATAAGATAGGTAATATCATTATTCCCTATTACATATGAATAAATTGGGCTCTGAGAGGCCAGAAAATGTCTCCACAATTATGAAGCTAATTAGTGGAAATGCCAACATTCTAATCCCAAGTAGACTGACTCCAAAGTCTAGTCCTTTAACAATAACACTATGTCACCTCTACCTCCTTAATACAGATATTGTAATACTTTTAGATGCCTAACAGTTCCACCCCTACCATCGGTCTAAATAGAATGACAACACTATCTACATATGCAGTAAAACCTGCCAATCATTTTTTAAAACTTAATTTCAACTCTGGGATCTTAGCCTCAGAAAGACAGAAGCTTTCTGTCATTTTTTCTCTTTCTGAATAAACATAAGATGGAAAAGAAGTGGTAAAAGCATGACATGAAGGGGAAGGGAGAAGGGCACTCTAAAAGCATAATTTTCTCCTAGTATCTTTGATTCTGCTGTTTCAG。

圖1 pBABE pure載體的酶切位Fig.1 Enzyme cleavage sites of pBABE vector

1.5 人骨髓間充質干細胞轉染lncRNA-1708慢病毒載體、干擾質粒及陰性對照

將收集到的病毒上清液0.3 mL與hBMSC培養(yǎng)液混勻，比例為0.3 mL病毒上清液加入0.7 mL細胞培養(yǎng)液和 1.0 μL polybrene（終濃度 8 ng/mL）。然后將混好的病毒感染液加入到hBMSC培養(yǎng)皿中，此時細胞密度不宜超過60%，過夜培養(yǎng)后更換新的hBMSC培養(yǎng)液，獲得轉染lncRNA-1708過表達載體、shlncRNA-1708干擾質粒及轉染相應陰性對照的骨髓間充質干細胞。2 d后收集細胞抽提RNA，RT-PCR檢測lnc-1708的表達。

1.6 RT-PCR檢測成骨相關因子的表達

P3代hBMSC以2×104個/cm2孔接種于96孔板中，以每豎列的3孔為一組，分別轉染lncRNA-1708過表達慢病毒載體、sh-lncRNA-1708干擾質粒及其相對應的陰性對照、轉染后成骨誘導分化培養(yǎng)14 d，14 d后收集細胞，RT-PCR檢測相關成骨基因RUNX2和ALP mRNA的表達量。引物設計，RUNX2 forward：5′-TTCACCTTGACCATAACCGTC-3′，reverse：5′-GGCGGTCAGAGAACAAACTAG-3′；ALP forward：5′-AGAATCTGGTGCAGGAATGG-3′，reverse：5′-TCGTATTTCATGTCTCCAGGC-3′；Sh-lncRNA-1708 forward：CCGGGTCACCTCTACCTCCTTAATACTCGAGTATTAAGGAGGTAGAGGTGACTTTTTG，reverse：AATTCAAAAAGTCACCTCTACCTCCTTAATACTCGAGTATTAAGGAGGTAGAGGTGAC。

1.7 堿性磷酸酶染色

將轉染lncRNA-1708過表達慢病毒或sh-lncRNA-1708或相關陰性對照的間充質骨髓干細胞以每孔2×104個細胞接種于6孔板內，成骨誘導培養(yǎng)14 d后，按堿性磷酸酶染色試劑盒說明書進行ALP染色。實驗組及相關陰性對照細胞吸去培養(yǎng)基，用PBS洗一遍，加入40 g/L多聚甲醛溶液，室溫固定3 min，固定好的細胞中加入適量配好的染液，避光靜置15～30 min，15 min之后每隔5 min觀察一次，待染色效果良好時，再用PBS洗一遍，即可觀察染色結果。

1.8 構建lncRNA-1708的CNC共表達網絡

對本次實驗前期的測序結果，我們采用了生物信息學軟件Cytoscape對差異表達lncRNA和mRNA數據進行相關性分析，并根據結果構建了lncRNA-1708與目標靶基因的CNC共表達網絡。設置lncRNA和mRNA之間Pearson相關系數≥0.9，以進一步討論lncRNA-1708的機制研究。

1.9 數據處理

采用GraphPad Prism 7制作統(tǒng)計學圖，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，lncRNA-1708、ALP、RUNX2表達量采用2-ΔΔCT方法計算，用Shapiro-wilk方法進行正態(tài)性檢驗，并進行方差齊性檢驗。各組與對照組表達量的比較使用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA-1708在3組人骨髓間充質干細胞成骨分化前后的差異性表達

將3組來自不同個體hBMSC的實驗組（P group）P3代細胞經成骨誘導分化培養(yǎng)7 d后測定lncRNA-1708表達量，與各組成骨誘導分化前（N group）相比較（N1-P1，N2-P2，N3-P3），3組中的lncRNA-1708表達量均較成骨誘導分化前降低。各組成骨誘導分化前后的lncRNA-1708表達量差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；圖2）。

圖2 hBMSC成骨誘導分化前與成骨分化后的lncRNA-1708表達量比較Fig.2 Comparison of relative expression of lncRNA-1708 after osteogenic differentiation of hBMSC

2.2 lncRNA-1708功能驗證實驗

2.2.1 LncRNA-1708過表達慢病毒及sh-lncRNA-1708的轉染效率的檢測 hBMSC分別轉染lncRNA-1708過表達慢病毒、sh-lncRNA-1708及其相對應的陰性對照，2 d后qRT-PCR檢測lncRNA-1708的表達量。在hBMSC轉染lncRNA-1708過表達慢病毒后，較轉染pBABE pure對照的細胞，lncRNA-1708表達量明顯升高（P＜0.05）。在轉染sh-lncRNA-1708的hBMSC后，較轉染PLKO.1載體對照的細胞，lncRNA-1708的表達量明顯下降（P ＜ 0.01；表1）。

2.2.2 上調或下調lncRNA-1708對成骨相關因子的影響 成骨誘導分化培養(yǎng)轉染后的hBMSC，14 d后RT-PCR檢測成骨標志因子RUNX2、ALP的mRNA表達量。在上調lncRNA-1708的hBMSC中，RUNX2及ALP的平均表達量分別是0.46±0.03、0.15±0.07（P ＜ 0.01，n=3）；在對照組轉染pBABE pure的hBMSC中RUNX2及ALP的平均表達量分別是1.00±0.02、1.02±0.28。差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，n=3；圖3A）。而在轉染shlnc-1708的hBMSC中，RUNX2及ALP的平均表達量分別是1.62±0.18、1.58±0.11（P ＜ 0.01，n=3），在轉染對照組PLKO.1空白載的hBMSC中RUNX2及ALP的平均表達量分別是1.00±0.04、1.01±0.18。差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01，n=3；圖3B）。

表1 hBMSC中Lnc-1708轉染效率檢測Table 1 Expression of lnc1708 in hBMSC after transfection

圖3 差異表達lnc-1708的hBMSC中相關mRNA的表達量Fig.3 The expression of mRNA in hBMSC of differential expression in cRNA-1708

2.3 過表達或沉默lncRNA-1708對人骨髓間充質干細胞成骨分化的堿性磷酸酶染色結果

在成骨分化的過程中，堿性磷酸酶實驗能夠直觀地判斷成骨分化后的效果，它可反映出成骨細胞的活性狀況。ALP染色細胞質呈紅色，提示ALP染色陽性。成骨誘導分化14 d后光鏡下觀察如圖4，ALP染色直觀圖如圖5。

2.4 lnRNAc-1708和mRNA共表達分析結果

我們采用生物信息學軟件Cytoscape對差異表達mRNA進行相關性分析，其中pearson相關系數（皮爾遜相關系數）≥0.9的共有13條mRNA（如圖6）。

3 討論

骨髓間充質干細胞是骨髓組織中的非造血干細胞，其具有多向分化潛能和高度的自我更新及增殖能力。在一定條件下骨髓間充質干細胞可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種細胞，是人體組織修復的重要細胞來源，是目前骨組織工程研究領域的理想細胞譜系［8］。對其機制的探究有助于骨組織工程的臨床運用。

圖4 成骨誘導分化14 d后堿性磷酸酶染色結果Fig.4 Alkaline phosphatase staining results 14 d after induction

圖5 成骨誘導分化14 d后堿性磷酸酶染色直觀圖Fig.5 Alkaline phosphatase staining under naked eyes 14 d after induction

圖6.LnRNAc-1708的CNC共表達網絡圖Fig.6 The coding-non-coding gene co-expression network of lncRNA-1708

LncRNA是一種長度超過200 nt的非編碼RNA，占ncRNAs總量的80%以上［9］。許多功能性的lncRNA具有穩(wěn)定的二級結構、獨特的亞細胞定位以及組織特異性表達模式。越來越多的研究表明雖然lncRNA不直接參與蛋白質的編碼，但卻能夠通過參與DNA甲基化，參與調節(jié)基因的激活或沉默以及作為miRNA海綿及小分子RNA前體等多種方式來調節(jié)細胞的增殖和分化過程［10］。近年來，越來越多的研究發(fā)現lncRNA參與調節(jié)BMSC成骨分化。如Cao等［11］報道高糖環(huán)境通過抑制lncRNA AK028326和CXCL13的表達來抑制鼠類BMSC的成骨分化。Liang等［12］研究發(fā)現，H19可以作為miR-141和miR-22的海綿，通過經典的Wnt/β-catenin通路途徑來調節(jié)hBMSC的表達。Shang等［13］發(fā)現 TCONS_00041960通過作為miR-204-5p和miR-125a-3p內源性競爭RNA來調節(jié)大鼠的BMSC成骨分化。Wang等［14］研究發(fā)現在絕經后骨質疏松病人中，lncRNA MEG3通過增強miR-133a-3p的表達抑制了BMSC的成骨分化，加速骨質疏松癥的發(fā)生。

LncRNA-1708是我們在hBMSC成骨分化過程中利用高通量測序技術篩選出的差異表達倍數較大的全新長鏈非編碼RNA，目前尚未有關于其與成骨分化的相關研究報道。為探討LncRNA-1708在hBMSC成骨分化中的功能意義，本研究對LncRNA-1708進行了RT-PCR驗證。驗證的樣本來自3各不同個體的骨髓間充質干細胞，成骨誘導分化7 d后，3組樣本中的LncRNA-1708表達量均明顯降低，證實了我們之前的測序結果。同時，也提示LncRNA-1708可能作為抑制成骨分化的lncRNA參與hBMSC生理活動。

ALP、RUNX2是成骨分化過程中重要的轉錄因子，是成骨細胞分化的標志基因，在骨形成及骨代謝的信號通路中發(fā)揮著重要作用［15-16］。本次研究通過構建lncRNA-1708過表達慢病毒及干擾質粒轉染hBMSC的方法，發(fā)現lncRNA-1708的表達量與RUNX2、ALP的表達量呈現負相關，這進一步提示lncRNA-1708在hBMSC成骨分化中起著負向調節(jié)作用。

有文獻報道稱DLK1通過激活經典的NF-kB途徑介導增加炎性細胞因子Cxcl2、Ccl3的產生，以及上調免疫應答相關基因Tnfa、Il7來促進破骨細胞的生成和抑制成骨細胞的分化與活性［17-18］。而在lncRNA-1708的CNC共表達網絡中，我們發(fā)現lncRNA-1708和DLK1呈現高度相關，而且在之前的測序結果中l(wèi)ncRNA-1708和DLK1均表達下調。因此，我們提出設想，lncRNA-1708可能通過調控蛋白編碼基因DLK1的表達來抑制hBMSC的成骨分化。

綜上所述，本研究探究了在hBMSC體外成骨分化中LncRNA-1708的負向調控作用，但目前我們尚未對LncRNA-1708在hBMSC成骨分化中的具體作用機制進行研究，后續(xù)將探討LncRNA-1708與其高度相關的DLK1等基因的關系，探究LncRNA-1708是否可以作為一條新的調節(jié)路徑來調節(jié)成骨分化，以期為骨組織工程的臨床應用提供幫助。