鋅離子抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的巨噬細(xì)胞泡沫化

田 甜，周芳敏，湯勇波

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州510080）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種大動(dòng)脈疾病，可以通過(guò)斑塊破裂和血栓形成轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙耘R床事件，是導(dǎo)致心臟病和中風(fēng)的主要原因［1］。動(dòng)脈粥樣硬化不僅是種退行性疾病，還與炎癥有密切的關(guān)系［2］，它的特征是大動(dòng)脈中脂質(zhì)和纖維元素的積累，早期病變包括巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體CD36、SR-A等吞噬以修飾后LDL-C為主的膽固醇并在內(nèi)皮下積聚，稱為“泡沫細(xì)胞化”［3］。鋅是人體重要的微量元素，可以結(jié)合人體內(nèi)約10%的蛋白質(zhì)［4］。兩個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Zn transporters，ZnT）和Zrt-，Irt-相關(guān)蛋白（Zin-regulated，Iron-regulatedlike proteins，ZIP）基因共同調(diào)控鋅在細(xì)胞內(nèi)外及基質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能障礙可破壞細(xì)胞的鋅穩(wěn)態(tài)，從而引起糖尿病、心血管疾病和癌癥等各種疾病的發(fā)生和發(fā)展［5］。飲食鋅攝入不佳促進(jìn)血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化形成，且越多研究發(fā)現(xiàn)鋅有抗氧化和抗炎作用［6-7］。因此，本研究將從動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生最初的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬出發(fā)，研究鋅離子在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用并初步探究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人單核細(xì)胞THP-1（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。胎牛血清（Foetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，BI公司），RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），丙二醇甲醚醋酸酯（Propylene glycol methyl ether acetate，PMA）、氯化鋅（Zinc chloride，ZnCl2）、N，N，N′，N′-四（2-吡啶甲基）乙二胺（N，N，N，N′-tetrakis（2-pyridinylmethyl）-1，2-ethanediamine，TPEN，Sigma公司）。油紅O、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）、1，1-二十二烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚菁（DiI）標(biāo)記的oxLDL（DiI-oxLDL，奕源公司）、CD36一抗體（R&D公司），SR-A一抗（Abcam公司），多克隆二抗（SantaCruz公司，博士徳公司，CST公司），小鼠β-actin一抗，ZIP7一抗（SantaCruz公司），ZIP8一抗（protein-tech公司），ZIP12一抗（Pro-sci公司），ZIP14一抗（Abcam公司）。Trizol（Invitrogen公司），引物序列（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光探針（Roche公司）。ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠（c57bcl/6），SPF級(jí)，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011（維通利華公司）。動(dòng)物飼料定制（派克公司）。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.1027-156），寄養(yǎng)于中山大學(xué)（北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），并根據(jù)中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RMPI 1640培養(yǎng)基中，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。1×106/皿接種于30 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基中加入分化誘導(dǎo)劑PMA使終濃度為0.1 mg/L，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。去PMA換新鮮全培養(yǎng)基，加入oxLDL繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h；或分化后采用不同濃度0、30和60 μmol/L的Zn2+或0.4、0.8 μmol/L的TPEN預(yù)孵育6 h后，再用oxLDL處理24 h，觀察巨噬細(xì)胞脂滴沉積情況及檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)mRNA水平和蛋白的表達(dá)情況。

將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分4組，正常飼料組（鋅含量30 mg/kg，Chow group）、高脂正常鋅組（鋅含量30 mg/kg，HFD）、高脂缺鋅組（鋅含量0 mg/kg，HFD-ZnD）、高脂高鋅組（鋅含量150 mg/kg，HFD-ZnS）。

1.3 油紅O染色

去掉培養(yǎng)基的細(xì)胞或新鮮分離的小鼠主動(dòng)脈條，用4℃PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛中固定10 min。再用4℃PBS洗3次，染色前用體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇潤(rùn)洗細(xì)胞，然后在37℃下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%油紅O染色5 min，染色后用異丙醇潤(rùn)洗一次，再用4℃PBS漂洗3次，最后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況或拍照，用image J計(jì)算泡沫化面積。

1.4 巨噬細(xì)胞對(duì)DiI-oxLDL攝取能力測(cè)定

將THP-1細(xì)胞接種于共聚焦（confocal）顯微鏡專用皿中，0.1 mg/L PMA處理48 h使之分化成巨噬細(xì)胞。將confocal皿中的培養(yǎng)液吸去，換成2 mL不含血清及抗生素的培養(yǎng)基，加入0.4 μmol/L TPEN或 60 μmol/L Zn2+6 h后，再加入100 mg/L oxLDL培養(yǎng)24 h，加入20 ng/L的DiI-oxLDL，在避光條件下分別在37℃孵育4 h，之后用4℃PBS洗，40 g/L多聚甲醛固定10 min，吸去固定液，4℃PBS洗3次，加入細(xì)胞核染料DAPI染色5 min，去染色液PBS洗滌。最后用熒光顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞對(duì)其攝取情況。其激發(fā)波和發(fā)射波波長(zhǎng)分別設(shè)置為520 nm和580 nm，每個(gè)皿取6個(gè)視野，運(yùn)用fluorescence View軟件測(cè)定每個(gè)皿6個(gè)視野內(nèi)所有細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

1.5 Western Blotting

Western blot用于檢測(cè)SR-A、CD36等蛋白的表達(dá)。將處理后的細(xì)胞用4℃PBS沖洗細(xì)胞3次，預(yù)先將蛋白酶抑制劑（cock tail）按1∶100加入細(xì)胞裂解液RIPA中混勻。加入適量裂解液（RIPA）冰上裂解細(xì)胞30 min。用細(xì)胞掛到將裂解產(chǎn)物刮下或組織破碎后收集于1.5 mL EP管，12 000 r/min（r=11 cm）4℃離心15 min，吸取上清液，-20℃保存。取2 μL用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取40～80 μg蛋白在8%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，200 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。含蛋白樣品的PVDF膜在體積分?jǐn)?shù)5%牛奶的TBST緩沖液中室溫封閉1～2 h。室溫孵育相應(yīng)抗體2 h或4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，5 min/次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。ECL發(fā)光底物曝光顯影，用ImageJ分析目的條帶的光密度值。比較不同條件下各蛋白表達(dá)的變化情況。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

THP-1細(xì)胞接種于30 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，除去培養(yǎng)液，用4℃PBS洗3次，加入1 mL Trizol試劑，冰上放置30 min，收集后，每1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩混勻，室溫靜置 5 min，再4℃，12 000 r/min（r=11 cm）離心15 min。小心吸取上清轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜置10 min，再12 000 r/min（r=11cm）4 ℃離心10 min。吸去上清，用75%乙醇漂洗RNA沉淀，5 000 r/min（r=11 cm）4℃離心5 min。倒去乙醇，室溫空氣中干燥約10 min，隨后加入20 μL DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白分析儀進(jìn)行核酸定量。再根據(jù)試劑盒條件取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物設(shè)計(jì)使用NCBI軟件primer-BLAST進(jìn)行設(shè)計(jì)，RT-PCR，20 μL體系，反應(yīng)條件：CFX96（Bio-Rad）qPCR儀，95.0 ℃ 10 min、95.0 ℃ 15 s、60.0 ℃ 1 min，39個(gè)循環(huán)；95.0 ℃ 10 s、60.0 ℃ 15 s。運(yùn)用 CFXmanager的2-△△t法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算（表1）。

1.7 血脂檢測(cè)

將獲得的小鼠血液室溫靜置30 min，3 000 r/min（r=11 cm）離心10 min，小心吸取上清，收集得到血清。血清用于血脂四項(xiàng)，交由廣州達(dá)安基因公司進(jìn)行檢測(cè)，采用的檢測(cè)方法是酶法。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism5.0制作統(tǒng)計(jì)圖。連續(xù)性資料數(shù)據(jù)用x±s描述，繪制柱狀圖或點(diǎn)圖。偏態(tài)分布資料P50（P25，P75）描述，繪制箱式圖。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性時(shí)，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，多重比較采用Bonferroni法分析組間差異。數(shù)據(jù)非正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，多組比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，H檢驗(yàn)分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，多重比較采用Nemenyi法，此步驟運(yùn)用SPSS 19.0平均秩多重比較的功能實(shí)現(xiàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Table 1 Primers

2 結(jié)果

2.1 鋅離子對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程的影響

100 mg/LoxLDL處理細(xì)胞48 h使細(xì)胞發(fā)生泡沫化后，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)積聚大量脂質(zhì)，預(yù)處理TPEN絡(luò)合胞外鋅離子后可以加重巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚，缺鋅組油紅O密度比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）；而預(yù)孵育60 μmol/L的Zn2+則在此基礎(chǔ)上有所下降（P＜0.01），一定程度上減緩了脂質(zhì)的堆積。100 mg/L oxLDL處理細(xì)胞48 h后使發(fā)生巨噬細(xì)胞泡沫化后，與對(duì)照組相比，缺鋅組泡沫細(xì)胞對(duì)DiI-oxLDL的攝取含量無(wú)顯著增加；但補(bǔ)充鋅離子后，細(xì)胞內(nèi)DiI-oxLDL的攝取量降低（P＜0.01；圖1，2）。

2.2 不同鋅離子濃度對(duì)清道夫受體CD36、SR-A表達(dá)的影響

在正常培養(yǎng)條件下，巨噬細(xì)胞對(duì)SR-A蛋白表達(dá)較低。用0.4 μmol/L的TPEN預(yù)處理細(xì)胞，再用oxLDL處理細(xì)胞48 h后，泡沫細(xì)胞SR-A和CD36蛋白表達(dá)量比對(duì)照組顯著增加。15 μmol/L Zn2+預(yù)處理巨噬細(xì)胞與oxLDL組比（P＜0.05），SR-A蛋白和CD36蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05；圖3）。

圖1 缺鋅增加巨噬細(xì)胞泡沫化Fig.1 Zinc deficiency upregulated the formation of foam cells

圖2 缺鋅增加巨噬細(xì)胞攝取DiI-oxLDLFig.2 Zinc deficiency upregulated the DiI-oxLDL uptake by macrophage

2.3 巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中ZIP、ZnT的mRNA表達(dá)變化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ZIP、ZnT的mRNA表達(dá)變化。ZIP14（1.98±0.16）、ZIP12（2.50±0.40）、ZIP10（1.78±0.12）的mRNA表達(dá)量均有所升高，其中又以ZIP12和ZIP14變化最為顯著（P＜0.05）。ZIP4（0.33±0.09）、ZIP7（0.32±0.08）、ZIP8（0.31±0.08）的mRNA表達(dá)量均降低。而ZnT4的mRNA表達(dá)量上調(diào)（2.86±0.23），ZnT1的mRNA表達(dá)量下調(diào)（0.25±0.004；P ＜ 0.05；圖4）。

2.4 不同鋅飲食對(duì)小鼠血脂的影響

用酶法檢測(cè)了血脂四項(xiàng)，結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)13周之后，與Chow組對(duì)比，HFD和HFD-ZnD組小鼠的血脂多項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高（P＜0.05；表2），HFD-ZnS組小鼠的LDL-C含量較HFD-ZnD組小鼠的LDL-C則有明顯下降（P＜0.05；表2）。

2.5 不同鋅飲食對(duì)小鼠動(dòng)脈SR-A蛋白表達(dá)的影響

利用ApoE-/-小鼠進(jìn)行高脂飲食飼養(yǎng)，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型13周后，HFD組和HFD-ZnD組與Chow組相比，SR-A蛋白表達(dá)均有明顯升高（P＜0.01）。而HFD-ZnS組的蛋白表達(dá)則在HFD組基礎(chǔ)上顯著降低（P＜0.01；圖5）。

2.6 不同鋅飲食對(duì)小鼠動(dòng)脈斑塊形成的影響

建立動(dòng)脈粥樣硬化模型13周后，油紅O染色顯示，與常Chow相比，HFD-ZnD組主動(dòng)脈粥樣斑塊明顯加重（P＜0.01）。HFD-ZnS組則在此基礎(chǔ)上有所減緩（P ＜0.01；圖6）。

圖3 不同鋅離子濃度對(duì)清道夫受體SR-A、CD36蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Zn2+on SR-A and CD36 protein expression in macrophages foam cell formation

圖4oxLDL影響鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體家族mRNA的表達(dá)Fig.4 Effect of ox-LDL on the mRNA expression of ZIP and ZnT family

表2 小鼠血清脂質(zhì)含量Table 2 Serum lipid，lipoprotein

圖5 不同鋅飲食小鼠血管SR-A蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of different diet on SR-A protein expression in the aorta of mice

圖6 不同鋅飲食對(duì)小鼠主動(dòng)脈斑塊形成的影響Fig.6 The effect of zinc on atherosclerosis plaque formation in aorta of mice

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探討了鋅離子在動(dòng)脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞泡沫化及斑塊形成過(guò)程中的影響及其機(jī)制，以往關(guān)于鋅與動(dòng)脈粥樣硬化的研究并不是特別多［8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，缺鋅導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增加，清道夫受體SR-A和CD36增加，可推測(cè)鋅離子參與細(xì)胞泡沫化過(guò)程，其參與機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控清道夫受體SR-A和CD36的表達(dá)，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。我們知道清道夫受體SR-A和CD36是參與動(dòng)脈斑塊形成的關(guān)鍵蛋白，降低它有抑制板塊形成［9］。巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL的過(guò)程中，鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnT和ZIP家族的mRNA水平均有顯著性改變，證實(shí)鋅離子參與調(diào)控清道夫受體SR-A和CD36蛋白，并且可能是通過(guò)改變巨噬細(xì)胞表面的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體影響細(xì)胞內(nèi)外鋅環(huán)境從而影響該過(guò)程。首次關(guān)注了影響胞內(nèi)鋅離子濃度的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體，這可能為研究提供一個(gè)新的方向［10］。但在變化較為明顯的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體中，又是哪些起到了關(guān)鍵性的作用其分子機(jī)制又是什么，還需要進(jìn)一步探討。

為了證實(shí)缺鋅及補(bǔ)充鋅對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有無(wú)直接的影響，我們建立了小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺鋅高脂飲食不但明顯促進(jìn)了ApoE-/-小鼠血清中LDL-C水平升高，還加重高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊的形成，證實(shí)缺鋅會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。鋅補(bǔ)充飲食則抑制高脂飲食的小鼠LDL-C水平升高和輕高脂誘導(dǎo)的動(dòng)脈斑塊增加，說(shuō)明對(duì)高血脂者給予適當(dāng)?shù)匿\補(bǔ)充或許可以有效減少血脂沉積和動(dòng)脈斑塊的形成，鋅在降低動(dòng)脈粥樣硬化這樣的血管疾病能獲益［8，11-12］。同樣地，關(guān)于不同飲食會(huì)否對(duì)鋅離子通道產(chǎn)生影響也還需要實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明。此外，基于鋅對(duì)血管的保護(hù)作用，而它除了作用于巨噬細(xì)胞，對(duì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞又有無(wú)僅有的積極調(diào)節(jié)作用也值得思考［13-14］。

綜上所述，鋅離子對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程能起到明顯的減緩作用。先前的研究，不管是通過(guò)低密度脂蛋白受體敲除（LDL-R-/-）小鼠和ApoE-/-小鼠上證實(shí)了缺鋅會(huì)促進(jìn)長(zhǎng)期高飽和脂肪和高膽固飲食導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊鈣化［15］，還是攝入鋅可能對(duì)降低動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)有益［16］，都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一致性。關(guān)于鋅在心血管疾病中的作用，還需要了解細(xì)胞內(nèi)鋅信號(hào)是如何發(fā)生的以及這些鋅轉(zhuǎn)移信號(hào)是怎樣影響細(xì)胞的狀態(tài)和功能。只有了解了這些機(jī)制才能確立鋅在動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中的預(yù)防和治療作用［8，17］。